Profilage sérologique quantitatif multiplexé du COVID-19 à partir du sang par un test au point de service

Les tests sérologiques hautement sensibles, spécifiques et au point de service (POC) sont un outil essentiel pour gérer la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19). Ici, nous rapportons un test POC microfluidique qui peut profiler la réponse en anticorps contre plusieurs antigènes du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) - le pic S1 (S1), la nucléocapside (N) et le domaine de liaison au récepteur (RBD) ) - simultanément à partir de 60 l de sang, de plasma ou de sérum. Nous avons évalué les niveaux d'anticorps dans des échantillons de plasma de 31 individus (avec échantillonnage longitudinal) avec un COVID-19 sévère, 41 individus en bonne santé et 18 individus avec des infections saisonnières à coronavirus. Ce test POC a atteint une sensibilité et une spécificité élevées, a suivi la séroconversion et a montré une bonne concordance avec un test de microneutralisation de virus vivants. Nous pouvons également détecter un biomarqueur pronostique de sévérité, IP-10 (interféron-γ–induit protéine 10), sur la même puce. Parce que notre test nécessite une intervention minimale de l'utilisateur et est lu par un détecteur portable, il peut être déployé dans le monde entier pour lutter contre le COVID-19.

INTRODUCTION

La pandémie actuelle de coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) pose un énorme défi au monde. Le SRAS-CoV-2 a entraîné plus de 100 millions de cas de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) dans le monde, entraînant plus de 2,3 millions de décès au 12 février 2020 (1). Contrairement à de nombreux autres virus, le SRAS-CoV-2 présente une infectivité élevée, une grande proportion de porteurs asymptomatiques et une longue période d'incubation pouvant aller jusqu'à 12 jours, au cours de laquelle les porteurs sont infectieux (2-4). En conséquence, la transmission s'est généralisée, entraînant des capacités de soins de santé débordées à travers le monde (5, 6). Des tests de diagnostic et de surveillance opportuns, fiables et précis sont nécessaires pour contrôler l'épidémie actuelle et prévenir de futurs pics de transmission.

La transcription inverse de la réaction en chaîne par polymérase (RT-PCR), qui détecte les acides nucléiques viraux, est l'étalon-or actuel pour le diagnostic de COVID-19 (7, 8). Bien que la RT-PCR soit très sensible et spécifique (9, 10), elle ne détecte pas les infections passées - l'ARN n'est généralement présent qu'en grande quantité lors d'une infection aiguë - et ne donne pas de renseignements sur la réponse de l'hôte à l'infection (11). Les tests sérologiques, qui détectent les anticorps induits par le SRAS-CoV-2, sont un complément crucial aux tests d'acide nucléique pour la gestion du COVID-19 (12, 13). Plus précisément, les tests sérologiques sont importants pour suivre la réponse immunitaire du corps (14) et potentiellement informer le pronostic (15) ou le statut immunitaire (12). Les tests sérologiques sont également essentiels pour une utilisation dans les études épidémiologiques (16) et sont un outil essentiel pour le développement de vaccins (17).

Le SRAS-CoV-2 est un virus à ARN enveloppé avec quatre protéines structurelles : protéine de pointe (S), protéine membranaire (M), protéine enveloppée (E) et protéine de nucléocapside (N) (18). Au fur et à mesure que la pandémie se déroulait, plusieurs tests de liaison sérologiques ont été développés, notamment des tests immuno-enzymatiques (ELISA) et des tests de flux latéral (LFA). Ces tests mesurent soit le niveau d'anticorps total, soit celui d'isotypes d'anticorps spécifiques qui se lient aux protéines virales, normalement S ou N. Plusieurs études ont démontré une sensibilité et une spécificité cliniques prometteuses pour ELISA et certains LFA (19, 20). En outre, il a été démontré que plusieurs ELISA sont bien corrélés avec les titres d'anticorps neutralisants (21, 22) et peuvent donc être utiles en clinique et dans le développement de vaccins (23). Cependant, ELISA et LFA présentent des inconvénients majeurs qui limitent leur applicabilité pour la gestion du COVID-19. ELISA nécessite une expertise technique, une infrastructure de laboratoire et de multiples étapes d'incubation et de lavage, limitant son applicabilité aux paramètres en dehors d'un laboratoire centralisé (24). D'autre part, les LFA sont portables, mais ils ont une sensibilité plus faible et fournissent des résultats qualitatifs (25), alors qu'une lecture quantitative est préférée pour une utilisation clinique, des études de recherche et des applications de surveillance. Collectivement, ces lacunes des ELISA et des LFA motivent le besoin d'un test au point de service (POCT) facilement déployable qui peut être fabriqué en grands volumes, a des valeurs quantitatives de mérite égales aux tests en laboratoire et est aussi facile à utiliser comme ZPH.

Pour relever le défi de créer un test convivial et largement déployable qui peut détecter une exposition antérieure et une réponse immunologique contre le SRAS-CoV-2, nous avons développé un nouveau test sérologique COVID-19 portable multiplexé qui est décrit ici. Notre plate-forme microfluidique passive permet une détection sensible et quantitative des anticorps contre plusieurs antigènes viraux du SRAS-CoV-2 en 60 min avec un seul test à partir d'une seule goutte de 60 l de sang, de plasma ou de sérum. Nous avons choisi de quantifier la réponse anticorps contre trois antigènes différents du SRAS-CoV-2 car des études émergentes ont démontré que la cible antigénique principale de la réponse immunitaire humorale peut informer la progression de la maladie et le pronostic (14). Ainsi, être capable de différencier les cibles virales des anticorps, comme nous le pouvons avec notre plateforme, peut être particulièrement précieux. De plus, notre test portable est entièrement automatisé et peut fonctionner au POC indépendamment d'un laboratoire centralisé en utilisant uniquement un détecteur portable peu coûteux. Nous montrons également que notre test peut être facilement modifié pour détecter des biomarqueurs protéiques supplémentaires, tels que des cytokines/chimiokines, sans compromettre les performances du test sérologique, ce qui peut fournir des informations cliniques supplémentaires sur la gravité de la maladie et/ou les résultats pour les patients (2, 26, 27). Collectivement, ces attributs suggèrent que notre plate-forme est un outil précieux pour la gestion du COVID-19 à la fois au niveau du patient individuel (c'est-à-dire le suivi des patients qui peuvent évoluer vers une maladie grave) et pour les études épidémiologiques à grande échelle au niveau de la population. De plus, cette plate-forme est modulaire et peut être facilement modifiée pour détecter d'autres agents pathogènes ou marqueurs de diagnostic simplement en utilisant un ensemble différent de réactifs biologiques.

RÉSULTATS

Le POCT DA-D4 pour la sérologie COVID-19

Notre stratégie pour évaluer la réponse des anticorps au SRAS-CoV-2 est basée sur la plateforme de dosage D4, développée récemment et rapportée ailleurs (28). La plate-forme D4 est une plate-forme de dosage immunologique entièrement autonome fabriquée sur une brosse en poly(oligoéthylène glycol méthyl éther méthacrylate) (POEGMA), où tous les réactifs nécessaires pour compléter le dosage sont imprimés par jet d'encre directement sur la surface. Dans des travaux antérieurs, nous avons utilisé cette plate-forme pour la détection de plusieurs biomarqueurs protéiques en utilisant un format d'immunoessai fluorescent en sandwich (28). Ici, nous avons modifié la conception du test pour détecter les anticorps contre le SRAS-CoV-2 à l'aide d'un format de test immunologique de pontage à double antigène (DA), qui détecte les anticorps totaux (tous les isotypes et sous-classes). Le DA-D4 est fabriqué par impression à jet d'encre d'antigènes viraux sous forme de points de capture stables et spatialement discrets. De plus, les antigènes viraux sont marqués avec une étiquette fluorescente et sont imprimés à proximité sur un tampon excipient sous forme de spots solubles. Lorsqu'un échantillon est ajouté au test (Fig. 1A, i), le tampon excipient se dissout et libère l'antigène marqué par fluorescence (Fig. 1A, ii), qui diffuse ensuite à travers la brosse en polymère vers les points de capture et marque tout anticorps qui a été capturé à partir de la solution par les taches de capture stables de l'antigène non marqué (Fig. 1A, iii). L'intensité de fluorescence des taches de capture est ensuite imagée à l'aide d'un détecteur fluorescent et des échelles avec la concentration d'anticorps dans un échantillon (Fig. 1A, iv). Étant donné que les points de capture de chaque antigène sont imprimés à des emplacements spatialement discrets, cette conception permet la quantification multiplexée de plusieurs anticorps cibles à l'aide d'une seule étiquette fluorescente, ce qui simplifie grandement la conception du détecteur et la lecture du test.

Fig. 1 Schéma DA-D4 POCT et validation analytique.(UNE) Schéma de la puce de dosage DA-D4. Les antigènes de capture S1, RBD et N et les antigènes de détection S1 et N-NTD (dAg) marqués par fluorescence sont imprimés par jet d'encre sur un substrat POEGMA. Lorsqu'un échantillon est ajouté, des dAg sont libérés de la surface en raison de la dissolution du tampon de tréhalose sous-jacent. Les anticorps ciblant chaque antigène viral relient ensuite les antigènes de capture aux dAg, ce qui donne un signal de fluorescence qui évolue avec la concentration d'anticorps. (B) DA-D4 au format ouvert avec 24 tests individuels. (C) Microfluidique DA-D4. L'échantillon est ajouté à l'entrée d'échantillon (SI), remplissant la chambre de réaction (R) qui contient les réactifs de dosage. Le tampon de lavage (WB) est ajouté au réservoir WB, qui chasse l'échantillon à travers la cassette microfluidique. Le canal de synchronisation (TC) définit le temps d'incubation. Tout le liquide est finalement absorbé par le tampon à mèche (WP) après le processus d'incubation. La taille est celle d'une lame de microscope standard. (ré) D4Scope et vue en coupe du chemin optique. La cellule d'écoulement microfluidique est insérée sur la gauche et une pression sur un bouton automatise l'excitation laser, l'exposition de la caméra et la sortie des données. (E) Validation analytique du format ouvert DA-D4. Les anticorps ciblant chaque antigène ont été ajoutés à du sérum humain non dilué et incubés pendant 30 min. Chaque point de données représente la moyenne de trois exécutions indépendantes et les barres d'erreur représentent le SEM. a.u. unités arbitraires. (F) Validation analytique du DA-D4 microfluidique. Chaque point de données pour un antigène représente la moyenne de quatre cellules d'écoulement microfluidiques indépendantes et les barres d'erreur représentent le SEM. (g) Des spots D4 représentatifs indiqués pour chaque dose. Crédit photo pour (B) à (D)  : David S. Kinnamon, Duke University.

Pour fabriquer un test sérologique pour le SRAS-CoV-2, la nucléocapside (N), le domaine de pointe S1 (S1) et le domaine de liaison au récepteur (RBD) de S1 ont été imprimés à jet d'encre en tant que réactifs de capture « stables » sur des lames recouvertes de POEGMA. Notre justification pour le dosage simultané de la réponse des anticorps contre les antigènes N, S1 et RBD est qu'il n'est pas entièrement compris quels épitopes déclenchent une réponse immunitaire chez tous les individus, bien qu'ils soient tous considérés comme immunogènes (29, 30) et parce que des études ont ont montré que la cible principale de la réponse immunitaire peut éclairer le pronostic de la maladie (14). N est exprimé abondamment par le SRAS-CoV-2 pendant l'infection et est hautement immunogène dans d'autres coronavirus (31, 32). La protéine S, composée des domaines S1 et S2, est exposée sur la couche virale du SRAS-CoV-2 et joue un rôle essentiel dans l'attachement, la fusion, l'entrée et la transmission du virus (33). Étant donné que S2 est hautement conservé dans de nombreux coronavirus et est donc potentiellement réactif de manière croisée, S1 a été choisi pour la détection des anticorps (34). Le RBD, la portion de S1 qui se lie aux cellules exprimant le récepteur viral, est la cible de nombreux anticorps neutralisants et constitue donc une cible antigénique prometteuse pour les tests sérologiques (34). La figure S1 montre la disposition et les dimensions d'une puce DA-D4 au format ouvert. Chaque puce contient 24 tests individuels avec les antigènes S1, RBD et N disposés en rangées séparées de cinq spots identiques d'un diamètre d'environ 170 m. Ensuite, des conjugués fluorescents de S1 - qui contient la séquence d'acides aminés pour RBD - et le domaine N-terminal (NTD) de N (produit en interne, voir fig. S2A pour l'électrophorèse sur gel SDS-polyacrylamide de l'expression et de la purification) ont été mélangés 1 :1 et imprimés au jet d'encre sous forme de 12 points identiques de 1 mm de diamètre sur un tampon de tréhalose de taille identique (fig. S1A). N-NTD - au lieu de N complet - a été choisi comme réactif de détection car le N complet peut se dimériser en solution, conduisant potentiellement à un résultat faussement positif dans le format DA (fig. S2B) (35). En raison de ce choix de réactifs, notre test ne détecte que les anticorps dirigés contre la région N-terminale de N.

Validation analytique du POCT DA-D4 à partir d'échantillons simulés

Nous avons d'abord cherché à démontrer que le test DA-D4 peut détecter des anticorps contre les antigènes du SRAS-CoV-2 exprimés de manière recombinante. Initialement, les performances analytiques ont été caractérisées à l'aide du format ouvert DA-D4 (Fig. 1B). En effet, le test DA-D4 au format ouvert a été largement optimisé et caractérisé par notre groupe et présente une sensibilité analytique extrêmement élevée, ce qui nous permet de déterminer les chiffres de mérite théoriquement possibles pour un test D4 particulier. Un inconvénient du dosage DA-D4 en format ouvert est cependant qu'il nécessite une étape de rinçage par l'utilisateur après incubation de l'échantillon (28).

Pour le déploiement du POC et une meilleure expérience utilisateur, nous avons développé, au cours de cette étude, une nouvelle cellule d'écoulement microfluidique « passive » à commande par gravité et capillaire qui automatise entièrement le test (Fig. 1C). La cellule d'écoulement microfluidique est fabriquée en adhérant des couches complémentaires de feuilles acryliques et adhésives découpées au laser de précision sur un substrat POEGMA fonctionnalisé (fig. S1B et S3 pour la mise en page d'impression). La cellule d'écoulement microfluidique résultante comprend une chambre de réaction, un canal de synchronisation, une entrée d'échantillon, un réservoir de tampon de lavage et un tampon à effet de mèche qui automatise les étapes d'incubation, de retrait d'échantillon, de lavage et de séchage de l'échantillon. Cela simplifie l'expérience de l'utilisateur et limite la possibilité qu'un utilisateur effectue le test de manière incorrecte, car il suffit à l'utilisateur d'ajouter l'échantillon et une goutte de tampon de lavage dans la cassette. Après ~ 60 min, la cassette est prête pour l'imagerie avec un détecteur fluorescent sur mesure, le D4Scope (Fig. 1D).

Le D4Scope est un détecteur de fluorescence portable à faible coût ( 0,70 (P < 0.0001). For antibodies targeting N, the concordance between the two assays was not as strong, with only a moderate correlation between the DA-D4 results and MN data (fig. S8C). This is expected, as N resides inside the capsid of SARS-CoV-2 and is not relevant for functional neutralization (40). This is also reflected in the longitudinal sample set. For example, patient 1 at day 15 after symptom onset has strong neutralizing antibodies, as seen by the MN assay, despite a weak overall antibody level for N. Although future studies are required to validate the ability of neutralizing antibodies to confer protection, these results suggest that the DA-D4 assay could be used as a supplement to live virus neutralization assays, which typically require >48 heures et confinement de niveau de biosécurité 3.

Fig. 5 Corrélation avec le dosage MN.(UNE à F) Des dosages de MN ont été effectués sur chaque échantillon longitudinal (losanges noirs) comme décrit dans Matériels et méthodes. Le titre MN transformé en log est tracé sur l'axe de gauche superposé aux données d'anticorps de la figure 4 (tracé sur l'axe de droite).

Profilage des biomarqueurs pronostiques parallèlement aux tests sérologiques

42) - a été intégré dans le test DA-D4 à l'aide d'un test immunologique traditionnel en sandwich, comme décrit précédemment (28).

Avant de tester des échantillons de patients, nous avons cherché à confirmer que le test sérologique multiplexé est compatible (pas de réaction croisée) avec le test sandwich IP-10. Pour ce faire, nous avons fabriqué des puces au format ouvert contenant tous les réactifs nécessaires à la fois pour la sérologie COVID-19 et la détection IP-10 humaine. Tout d'abord, nous avons préparé une série de dilutions en 15 points d'IP-10 humain recombinant dopé dans du sérum bovin fœtal (FBS) - couvrant la plage physiologique pertinente pour les patients atteints de COVID-19 identifiés ailleurs (42) - et avons ajouté des échantillons aux puces en triple dans l'absence d'anticorps ciblant les antigènes du SRAS-CoV-2. Nous avons observé un comportement dépendant de la dose pour la réponse IP-10 avec une faible limite de détection (LOD) de 0,12 ng/ml (43) et une réactivité minimale pour les antigènes de capture du SRAS-CoV-2, confirmant que les composants du test IP-10 pas de réaction croisée avec les composants sérologiques (Fig. 6A). Ensuite, nous avons préparé une série de dilutions d'échantillons séropositifs simulés et les avons ajoutés aux puces au format ouvert. Dans toutes les concentrations d'anticorps anti-SRAS-CoV-2, l'intensité des anticorps de capture IP-10 était proche de la ligne de base, confirmant ainsi que les composants sérologiques n'interfèrent pas avec le test de détection IP-10 (Fig. 6B).

Fig. 6 Biomarqueur pronostique combiné et détection sérologique.(UNE) Courbe dose-réponse pour l'IP-10 recombinant dopé dans le FBS. Chaque point de données représente la moyenne (n = 3) et les barres d'erreur représentent le SEM. La limite de détection (LOD) pour IP-10 est de 0,12 ng/ml. (B) Courbe dose-réponse pour les anticorps anti-SRAS-CoV-2 dopés dans le FBS. La concentration la plus élevée est de 10 µg/ml d'anticorps anti-S1/RBD et de 10 µg/ml d'anticorps anti-N. Chaque point de données représente la moyenne (n = 3) avec SEM. (C) Corrélation entre la lecture DA-D4 pour IP-10 avec un ELISA effectué séparément. Les échantillons avec une lettre désignent les échantillons d'un individu à différents moments, où b survient plus tard dans la maladie que a. Tous les échantillons ont été testés en double sur le DA-D4 (avec SD montré) sauf 2b (en raison d'un volume insuffisant). La ligne continue montre la régression linéaire. (ré) Réactivité des anticorps contre S1, RBD et N pour l'échantillon testé en (C) (avec SD illustré). NC, contrôle négatif poolé de plasma sain.

Après avoir confirmé la compatibilité du test IP-10 avec la sérologie multiplexée au format ouvert D4, nous avons ensuite cherché à tester les performances de notre test sur des échantillons de patients. Dix échantillons de plasma positifs au COVID-19 (provenant de sept patients) ont été obtenus du biodépôt des soins intensifs et ont été ajoutés non dilués à des puces au format ouvert, puis évalués quantitativement par le DA-D4. Nous avons mesuré IP-10 et les anticorps contre S1, RBD et N simultanément sur le même appareil à partir d'un seul échantillon. Séparément, des échantillons de sérum provenant des mêmes patients ont été évalués en parallèle via des kits ELISA LEGENDplex qui rapportent la concentration IP-10 en picogrammes par millilitre. Nous avons observé une forte corrélation positive entre le test DA-D4 pour IP-10 avec ELISA sur les 10 paires de mesures, avec un r de Pearson de 0,918 [P = 0.0002, 95% confidence interval (CI) : 0.68 to 0.98] (Fig. 6C). Nous avons également testé la réactivité des anticorps envers S1, RBD et N à partir des mêmes échantillons et d'un échantillon supplémentaire de pool de plasma sain (contrôle négatif pré-COVID-19) (Fig. 6D). Bien que nous n'ayons pas observé de relation forte entre les niveaux d'anticorps et d'IP-10, nous avons observé que, chez les patients pour lesquels nous avons testé plusieurs échantillons, IP-10 diminuait avec le temps, tandis que les niveaux d'anticorps augmentaient.

Detection of additional prognostic biomarkers could also be implemented on the same chip, as long as there is no cross-reactivity between the assay reagents for serology and prognosis. For example, we recently developed a multiplexed assay to detect interleukin-6 (IL-6), N-terminal (NT)–pro-B-type natriuretic peptide (NT-proBNP), and D-dimer, which have all been implicated in disease progression and severity and could be added to our existing chip (fig. S9). A recent study found that the ratio of IL-6 to IL-10 can be used to guide clinical decision-making (44), which we plan to measure in the next generation of this assay.

DISCUSSION

As the COVID-19 pandemic unfolded, countries around the globe grappled with developing streamlined systems for diagnosis of acute infection using nucleic acid detection methods. Although there remains an urgent need for rapid and sensitive POCTs for acute diagnosis, developing accurate and reliable serological assays has been deemed an equally important endeavor to complement existing diagnostic strategies (12, 45). The challenge with developing an easy-to-use serology assay that can be broadly disseminated but that performs as well as centralized laboratory-based methods is highlighted by the large number of ELISA and LFA tests that have been developed. While LFAs are portable and easy to use and ELISAs are quantitative and highly sensitive, there remains a need for a technology that can merge the best attributes of each format.

easy to use, widely deployable, requires only a single 60-μl drop of blood, and can be performed with minimal user intervention. The SARS-CoV-2 DA-D4 assay can be used to measure antibody kinetics and seroconversion at the individual patient level directly from unprocessed blood or plasma. This test is highly sensitive and specific and is potentially suited for epidemiological surveillance at the population level using low-cost microfluidic cassettes that can be transported and stored for an extended period of time without a cold chain. Furthermore, it requires minimal user intervention to carry out the assay and provides a quantitative readout using a low-cost, handheld detector.

We show a strong correlation between the DA-D4 assay readout (for S1 and the RBD of S1) and neutralizing antibody titers, suggesting that this test may be useful in understanding efficacy and durability of natural or vaccine-induced humoral immunity and to potentially inform disease prognosis and population-level immunity. We also demonstrate that an additional prognostic biomarker can be easily incorporated into the test, which may be useful for monitoring disease severity and predict clinical outcomes. Combined, these attributes suggest that this platform may also be useful on the individual patient level to aid in clinical decision-making. While the results presented here mainly highlight the performance of the microfluidic chip, the open-format architecture with up to 24 individual assays per glass slide may be useful for scenarios where higher-throughput testing is demanded. The open format still has advantages compared to traditional ELISA because the open format only requires a single incubation step and one wash step, which reduces the hands-on time and equipment complexity required to complete the assay.

The DA-D4 has additional features that synergize to deliver a highly desirable serological assay. First, the DA sandwich format has advantages over other serological assay formats. Because total antibody is detected rather than a single antibody isotype or subclass, seroconversion in patients can be detected earlier, which reduces the chances of a false-negative result due to a test being administered too early in disease (39). Furthermore, because the labeled reagent does not have species specificity, the single assay kit could be used in preclinical vaccine development studies to measure antibody responses in experimental animals (23). The lack of species-specific detection antibodies also reduces the risk of high background signal caused by nonspecific antibodies binding to the surface and subsequently being labeled (46). Last, the DA-D4 can be conducted in a single step to accomplish multiplex detection without the need for an intermediate wash step, which other assay formats require.

Second, all reagents needed to complete the assay are incorporated onto the nonfouling POEGMA brush that eliminates virtually all nonspecific protein adsorption and cellular adhesion, thereby enabling an extremely low LOD directly from undiluted samples (47, 48). Although many serological assays often dilute samples, the ability to test undiluted samples is advantageous, especially when combined with prognostic biomarker testing where dilution of low-concentration analytes can lead to an undetectable signal. Testing multiple dilutions can still be performed using our test when antibody levels become high, which could be used to calculate specific titers. POEGMA also acts as a stabilizing substrate for printed reagents, enabling long-term storage of chips without a cold chain (28). In this study, results were generated over the course of 3 months from the same batch of tests stored in silica desiccated pouches at room temperature and ambient humidity.

N This is because each viral antigen is deposited at a spatially discrete location, which allows for a single fluorescent tag to be used during fluorescence imaging of the chip, thereby simplifying assay readout compared to other multiplexing technologies such as Simoa or Luminex assays, which rely on multiple different reporter molecules and a more complex readout (14, 49). This method also allows us to simultaneously measure the concentration of potential prognostic biomarkers directly from plasma (26, 27) without compromising the performance of the multiplexed serological assay. To the best of our knowledge, there are currently no tests on the market that can probe for antibodies against multiple viral antigens and prognostic protein biomarkers simultaneously.

Fourth, this platform is designed for POC deployment because it requires a single drop of blood that is readily obtained from a finger stick. This droplet is injected into the sample port of a gravity-driven microfluidic chip that requires no further user intervention beyond the concurrent addition of a few drops of wash buffer into a separate port. The assay runs by itself under the action of gravity and capillary action until all the fluid is drained from the microfluidic path by the absorbent pad at the bottom of the cassette, which fully absorbs and contains all liquid. This design eliminates the need for pumps, valves, or actuators and reduces the complexity and cost of the assay. Furthermore, it can be read out at the point of sample collection using the D4Scope, a highly sensitive and inexpensive handheld detector developed to work with the microfluidic chip. The D4Scope images a chip and provides a quantitative readout in less than 5 s, does not require an external power source or laboratory infrastructure, and can wirelessly transmit the results to a remote server over Wi-Fi. While smartphone-based diagnostics are becoming more popular, a benefit of this platform is that it does not rely on smartphone hardware and software, which change rapidly.

This platform could also be used as an inexpensive tool to study the longitudinal dynamics of antibody levels to inform reinfection potential as the testing is carried out with a disposable cassette and a low-cost, lightweight, and handheld detector whose production can easily be scaled up to enable widespread and dispersed deployment.

This may have caused our assay to underestimate the titer of anti-N antibodies for two reasons: (i) the bacterial expression system we used does not perform glycosylation, which could negatively impact antibody recognition, and (ii) the truncated form does not allow us to detect antibodies that are developed against the C-terminal domain, which also contains immunogenic epitopes (51). This limitation is compensated for by the fact that we can easily multiplex using the DA-D4 format and thus detect antibodies directed against different antigens to maintain high sensitivity and specificity. Despite these limitations, we believe that our assay is poised well to complement existing diagnostic solutions once additional validation studies encompassing larger patient cohorts are completed. We are actively developing an improved version of the test that requires less sample volume and has a shorter run time to better match the time to results and volume requirements of existing LFAs.

In summary, we have developed a COVID-19 serological assay that merges the benefits of LFAs and ELISAs. We used this test to simultaneously measure the antibody levels for multiple viral antigens and a potential prognostic biomarker directly from plasma and whole blood. For COVID-19 management, our platform may be useful to better understand patient antibody responses, provide actionable intelligence to physicians to guide interventions for hospitalized patients at the POC, to assess vaccine efficacy, and to perform epidemiological studies. Furthermore, our platform is broadly applicable to other diseases where sensitive and quantitative antibody and/or protein detection is desirable in settings without access to a centralized laboratory. Overall, we believe that our platform is a promising approach to democratize access to laboratory quality tests, by enabling rapid and decentralized testing with minimal user intervention to locations outside the hospital.

MATERIALS AND METHODS

DA-D4 assay

The DA-D4 assay is based on the design of the D4 immunoassay, reported elsewhere (28). Briefly, a polymer brush composed of POEGMA was “grafted from” a glass slide by surface-initiated atom transfer radical polymerization (48). Recombinant SARS-CoV-2 proteins were then printed onto POEGMA-coated slides as capture and detection spots. Capture spots of the following proteins were printed as ~170-μm-diameter spots using a Scienion S11 sciFLEXARRAYER (Scienion AG) inkjet printer : spike S1 (Sino Biological, catalog #40591-V05H1), spike RBD (Sino Biological, catalog #40592-V02H), and nucleocapsid protein (Leinco, catalog #S854). Each protein was printed as a row/column of five identical spots. Next, 12 excipient pads of trehalose with 1.6-mm spacing were printed from a 10% (w/v) trehalose solution in deionized water around the periphery of the capture antigen array using a BioDot AD1520 printer (BioDot Inc.). To print the detection reagents, S1 (Sino Biological, catalog #40591-V08H) and N-NTD (produced in-house) were first conjugated to Alexa Fluor 647 (per the manufacturer’s instructions) and then detection spots of the fluorescent protein conjugates of these proteins were printed on top of the excipient pads as 12 1-mm-diameter spots. A schematic of the chip that shows the spatial address and dimensions of the capture spots, trehalose pad, and detection spots is shown in fig. S1. After printing and final assembly, D4 chips were stored with desiccant until use. The amount of reagent deposited for the open format and microfluidic format was identical, with the only difference being the relative spot placement (fig. S1, A and B). For DA-D4 assays that also detected IP-10, an additional column of five spots of capture antibody (R&D Systems, catalog #MAB266) was included and anti–IP-10 detection antibody (R&D Systems, catalog #AF-266) was included in the detection cocktail for the open-format chips.

Fabrication and analytical testing of open-format DA-D4

Open-format slides were prepared by adhering acrylic wells to each slide, which splits one slide into 24 independent arrays (see fig. S1A for a schematic and Fig. 1B for an image). To validate the analytical performance of the test, dose-response curves were generated using antibodies targeting SARS-CoV-2 antigens (Sino Biological, catalog #40143-MM05, 40150-D001, and 40150-D004) spiked into undiluted pooled human serum. Open-format chips were incubated with a 13-point dilution series (run in triplicate) for 30 min, briefly rinsed in a 0.1% Tween 20/phosphate-buffered saline (PBS) wash buffer and then dried. Arrays were imaged on an Axon Genepix 4400 tabletop scanner (Molecular Devices LLC).

Fabrication and analytical testing of microfluidic DA-D4

The microfluidic chip fabrication process is described in detail in the Supplementary Materials. Briefly, the microfluidic chip was fabricated by adhering complementary layers of precision laser-cut acrylic and adhesive sheets onto a POEGMA substrate that had been functionalized with the relevant capture and detection reagents. The resulting assembly features a reaction chamber, timing channel, sample inlet, wash buffer reservoir, and wicking pad that automates the sample incubation, sample removal, wash, and drying steps. Simulated doses were prepared using antibodies targeting SARS-CoV-2 antigens (Sino Biological, catalog #40143-MM05, 40150-D001, and 40150-D004) spiked into undiluted pooled human serum. Six doses (including a blank) were tested on the microfluidic DA-D4 in the following way : (i) The user dispenses 60 μl of sample into the sample inlet using a pipette. (ii) The user dispenses 135 μl of wash buffer into the wash reservoir of the cassette using a pipette. (iii) The user waits 60 min for the cassette to run to completion. During this time, (a) fluorescently labeled antigens dissolve and form sandwiches with the antibodies of interest and the immobilized capture antigen in the reaction chamber. (b) A small volume of sample traverses the timing channel, which governs the incubation time. (c) The sample reaches an absorbent pad situated at the end of the timing channel that rapidly wicks away all sample from the reaction chamber, ending incubation. (d) As the sample clears, wash buffer enters the reaction chamber, removing residual sample and unbound reagent before it is also wicked away, leaving a cleaned and dry imaging surface. We observed a less than ±10% variation in the designed 23-min incubation time for the data presented in Fig. 1F. The remaining difference in time accounts for washing and drying time. (iv) The cassette is ready for analysis on the D4Scope. The vertical orientation of the cassette works in conjunction with the POEGMA brush to maintain low background fluorescence. Cellular and other sample debris can collect on the brush surface owing to gravitational forces, even if no binding is occurring. The vertical orientation ensures that these debris fall harmlessly toward the timing channel during the wash step. This proved especially important when testing with undiluted human whole blood samples.

Patient samples

De-identified heat-inactivated EDTA plasma samples (57°C for 30 min) were accessed from the Duke COVID-19 ICU biorepository (Pro00101196, PI Bryan Kraft) approved by the Duke Health Institutional Review Board (IRB) via an exempted protocol approved by the Duke Health IRB (Pro00105331, PI Ashutosh Chilkoti). Briefly, eligible patients included in the repository were men and women ages 18 years and above who were admitted to an adult ICU at Duke University Hospital with SARS-CoV-2 infection confirmed by PCR testing and who gave informed consent. Samples were collected on study days 1, 3, 7, 14, and 21. In addition to biological samples, clinical data on these patients were also collected including demographics, laboratory data, and clinical course. This study was performed in collaboration with the biorepository team and we have complied with all relevant ethical regulations.

Ten negative control plasma samples were collected under a normal blood donor protocol (Pro00009459, PI Tony Moody) and were collected from 2014 to 2019 (before the COVID-19 outbreak). All patient information, including demographics, is unknown to the investigator team. An additional 11 negative control samples were purchased commercially (Lee Biosolutions Inc.). Last, 20 negative control samples and 18 samples from patients infected with coronavirus 229E (n = 2), HKU1 (n = 4), NL63 (n = 2), and OC43 (n = 10) were collected under Pro00001698. All samples were accessed via an exempted protocol approved by the Duke Health IRB (Pro00105331, PI Ashutosh Chilkoti). Blood was either purchased commercially (Innovative Research Inc.) or accessed from the ICU biorepository (Pro00101196, PI Bryan Kraft) in EDTA-collection tubes and was tested within 48 hours of sample collection.

Testing of prepandemic healthy controls, specificity panel, and ICU samples on the microfluidic DA-D4

The plasma samples (prepandemic healthy controls, specificity panel, and ICU biorepository) were thawed from −80°C storage and allowed to reach room temperature before testing. Blood samples were tested at room temperature. The same procedure used to test the simulated samples as described in “Fabrication and analytical testing of microfluidic DA-D4” was used for testing of all clinical samples. The only exception was that a modified microfluidic flow cell described in the Supplementary Materials that required the use of 200 μl of wash buffer was used for testing whole blood.

D4Scope fabrication and operation

band-pass filter touchscreen Fully assembled, it weighs ~5 pounds. The D4Scope can be powered through either a portable battery pack or wall power. Once connected to the power source, the D4Scope automatically runs our custom imaging Python program. The user removes the light protection cover from the cassette loading port and slides the microfluidic cassette with the glass side toward the detector. The light protection cover is then replaced enclosing the cassette. The user is then prompted to enter the sample ID # and chip ID # using either the touchscreen or optional attached keyboard and mouse.

The D4Scope has two fine adjustment knobs on the cassette loading port that allow for precise vertically and horizontally movement of the cassette relative to the laser source to ensure that the DA-D4 array is perfectly centered with the excitation source. Each array has coprinted two control spots that will always be uniformly bright across all tested samples and align with two superimposed alignment cross hairs on the live video feed of the D4Scope. Using the “toggle video” function on the user interface activates the laser and camera to provide a live view of the imaging area for this alignment. Once aligned, the toggle video function can be pressed again to end the live view, and the “capture image” function can be used to collect and save the resulting image onto the on-board hard drive and, optionally, to a cloud-based server defined by the end user. The live-view feature should be used sparingly to prevent photobleaching of the sample. For this study, we manually analyzed the resulting fluorescence intensity using Genepix Analysis software. However, we have developed an algorithm for automatic analysis of spot intensity and instantaneous results on our open-format platform, which will be reported elsewhere.

Live SARS-CoV-2 MN assay

The SARS-CoV-2 virus (Isolate USA-WA1/2020, NR-52281) was deposited by the Centers for Disease Control and Prevention and obtained through BEI Resources, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health (NIH). SARS-CoV-2 MN assays were adapted from a previous study (52). In short, plasma samples are diluted twofold and incubated with 100 TCID50 (median tissue culture infectious dose) virus for 1 hour. These dilutions are transferred to a 96-well plate containing 2 × 104 Vero E6 cells per well. Following a 96-hour incubation, cells were fixed with 10% formalin and cytopathic effect (CPE) was determined after staining with 0.1% crystal violet. Each batch of MN includes a known neutralizing control antibody (clone D001; SINO, catalog #40150-D001). Data are reported as the inverse of the last dilution of plasma that protected from CPE, log10-transformed.

IP-10 experiments

Open-format DA-D4 slides were fabricated as described above using all reagents needed for antibody detection and IP-10 detection. Citrated plasma samples from 10 patients were procured from the ICU biorepository. Sixty microliters of each sample was added to two separate DA-D4 chips and incubated for 30 min, and the chips were then rinsed using 0.1% Tween 20 in 1× PBS. All slides were scanned with the Genepix tabletop scanner.

IP-10 levels were measured using the LEGENDplex Human Proinflammatory Chemokine Panel (13-plex) and LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel (13-plex) obtained from BioLegend. Assays were performed with patient serum per the manufacturer’s instructions. The assay was performed using a Beckman Coulter CytoFLEX flow cytometer, and data processing was performed using BioLegend’s Bio-Bits cloud-based software platform. Each sample was tested in triplicate, and the results are reported as the mean of these triplicates.

Statistical analysis

Statistical analysis was performed using GraphPad Prism version 8.4.1 (GraphPad Software Inc.). All data were log-transformed for analysis. To establish statistical significance between negative and positive cohorts (Fig. 2, B to D), unpaired t tests were used. Pearson’s r correlation was used to assess the degree of correlation between measurements and was calculated using GraphPad Prism.

REFERENCES AND NOTES

1. ↵
2. ↵
4. ↵
5. ↵
6. ↵
7. ↵
8. ↵
9. ↵
10. ↵
11. ↵
12. ↵
13. ↵
14. ↵
15. ↵
16. ↵
17. ↵
18. ↵
19. ↵
20. ↵
21. ↵
22. ↵
23. ↵
24. ↵
25. ↵
26. ↵
27. ↵
28. ↵
29. ↵
30. ↵
31. ↵
32. ↵
33. ↵
34. ↵
35. ↵
36. ↵
37. ↵
38. ↵
39. ↵
40. ↵
41. ↵
42. ↵
43. ↵
44. ↵
45. ↵
46. ↵
47. ↵
48. ↵
49. ↵
50. ↵J. Seow, C. Graham, B. Merrick, S. Acors, K. J. A. Steel, O. Hemmings, A. O’Bryne, N. Kouphou, S. Pickering, R. P. Galao, G. Betancor, H. D. Wilson, A. W. Signell, H. Winstone, C. Kerridge, N. Temperton, L. Snell, K. Bisnauthsing, A. Moore, A. Green, L. Martinez, B. Stokes, J. Honey, A. Izquierdo-Barras, G. Arbane, A. Patel, L. O’Connell, G. O’Hara, E. M. Mahon, S. Douthwaite, G. Nebbia, R. Batra, R. Martinez-Nunez, J. D. Edgeworth, S. J. D. Neil, M. H. Malim, K. J. Doores, Longitudinal evaluation and decline of antibody responses in SARS-CoV-2 infection. medRxiv 2020.2007.2009.20148429 (2020).
51. ↵
52. ↵

Acknowledgments: We thank D. Montefiori for providing laboratory space to complete the clinical validation studies. We also thank R. Sahm for completing live SARS-CoV-2 microneutralization assays, which were performed in the Virology Unit of the Duke Regional Biocontainment Laboratory, which received partial support for construction from the NIH/NIAD (UC6AI058607; GDS). We thank the nurses in the ICUs of Duke University Hospital for collecting the blood samples used for this study and thank P. Lee for supporting the ICU Biorepository. We thank T. Moody for access to the prepandemic negative control samples used in this study, T. Denny for providing access to BSL2+ laboratory facilities to run the prepandemic negative samples, and H. Register for assistance with testing the negative samples on the DA-D4 POCT. Funding : A.C. acknowledges the support of the National Science Foundation (grant no. CBET2029361); the National Cancer Institute through grants P30-CA014236, R01-CA248491, and UH3-CA211232; Department of Defense United States Special Operations Command (grant no. W81XWH-16-C-0219); Defence Academy of the United Kingdom (grant no. ACC6010469); and the Combat Casualty Care Research Program (JPC-6) (grant no. W81XWH-17-2-0045). B.D.K. receives funding from NHLBI (K08HL130557). Author contributions: J.T.H. and D.S.K. are co–lead authors, who equally participated in experimental design, data collection, data analysis, manuscript drafting, figure creation, and manuscript revision. L.B.O. participated in experimental design and collection and analysis of data for clinical validation. J.L. developed the D4Scope used throughout the study and drafted text and figures related to the D4Scope. D.S.K. C.M.F. and A.M.H. developed the microfluidic cassette. G.K. cloned, expressed, and purified the N-NTD. S.A.W. S.O. and Z.Q. participated in data collection and analysis. C.M.F. D.Y.J. and A.M.H. were responsible for conceptualization, investigation, and manuscript revision. C.P. oversaw statistical analysis and assisted in study design. J.G.A. and T.W.B. assisted in procurement and testing of negative control samples. T.O. designed and ran live virus microneutralization assays, analyzed data, and participated in writing the manuscript. G.D.S. participated in writing the manuscript. B.D.K. C.W.W. L.C. L.G.Q. S.K.N. B.A.S. I.A.N. and L.B.O. contributed to the development of the Duke COVID-19 biorepositories and oversaw clinical data acquisition. T.W.B. B.D.K. and C.W.W. participated in manuscript revision. A.C. is the principal investigator who directed the studies, helped plan experiments, analyzed data, and participated in writing and editing the manuscript. All authors read and approved the manuscript. Competing interests: A.C. D.S.K. C.P. A.M.H. J.L. and J.T.H. are inventors on two provisional patents related to this work filed by Duke University [no. 63/068,432, filed (21 August 2020), not yet published, and no. 63/116,511, filed (20 November 2020), not yet published]. Both are entitled “Microfluidic assay device” and both describe innovations used for the D4 microfluidic cassette described in this work. A.C. and J.L. are inventors on a patent related to this work filed by Duke University [no. WO/2020/223713, filed (2 May 2020), published (5 May 2020)]. The patent is entitled “Devices and methods for imaging microarray chips” and describes innovations used for the D4Scope described in this work. Immucor Inc. has acquired the rights to the D4 assay on POEGMA brushes for in vitro diagnostics from Sentilus Inc. (cofounded by A.C. and A.M.H.). All other authors declare that they have no competing interests. Data and materials availability : All data needed to evaluate the conclusions in the paper are present in the paper and/or the Supplementary Materials.

li comment="fn" id="copyright-statement-1">Copyright © 2021 The Authors, some rights reserved; exclusive licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original U.S. Government Works. Distributed under a Creative Commons Attribution NonCommercial License 4.0 (CC BY-NC)