L'infection par des coronavirus hautement pathogènes entraîne une apoptose importante. Cependant, la pertinence physiologique de l'apoptose dans la pathogenèse des infections à coronavirus est inconnue. Ici, avec une combinaison de modèles in vitro, ex vivo et in vivo, nous avons démontré que la signalisation de la protéine kinase R-like endoplasmic reticulum kinase (PERK) médiait les signaux pro-apoptotiques dans l'infection par le coronavirus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV), qui convergé dans la voie intrinsèque de l'apoptose. L'inhibition de la signalisation PERK ou de l'apoptose intrinsèque a tous deux atténué la pathogenèse du MERS in vivo. Le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) et le SRAS-CoV ont induit l'apoptose par des mécanismes distincts, mais l'inhibition de l'apoptose intrinsèque a également limité l'apoptose induite par le SRAS-CoV-2 et le SRAS-CoV in vitro et a nettement amélioré les lésions pulmonaires de souris de l'enzyme de conversion de l'angiotensine humaine 2 (hACE2) inoculées par le SRAS-CoV-2. Collectivement, notre étude fournit la première preuve que l'apoptose induite par le virus est un déterminant important de la maladie des coronavirus hautement pathogènes et démontre que ce processus peut être ciblé pour atténuer la gravité de la maladie.
INTRODUCTION
Trois coronavirus hautement pathogènes sont apparus au cours des deux dernières décennies et ont entraîné une mortalité et une morbidité importantes. Le coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV) est apparu en 2002 et a entraîné 8096 cas et 774 décès en moins d'un an (1). Le coronavirus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV) a été identifié en 2012 et a entraîné 2564 cas avec 881 décès en décembre 2020 (2). Récemment, le SRAS-CoV-2 est apparu en décembre 2019 et s'est rapidement propagé dans la population humaine, entraînant plus de 100 millions de cas et plus de 2 millions de décès en un an environ (3, 4). L'infection par ces coronavirus hautement pathogènes entraîne principalement des symptômes respiratoires, notamment une toux et un essoufflement, et pourrait évoluer vers une pneumonie sévère associée au syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA). Malgré l'impact de ces coronavirus hautement pathogènes, les recherches actuelles se sont concentrées sur leur prévention et leur traitement antiviral. Le mécanisme sous-jacent expliquant la forte pathogénicité de ces coronavirus pathogènes humains reste mal compris.
L'apoptose est une forme hautement régulée de mort cellulaire qui peut être initiée par l'hôte pour limiter la propagation du virus (5). Cependant, une apoptose excessive perturbe l'architecture et l'intégrité du réseau broncho-alvéolaire et contribue aux lésions pulmonaires et au SDRA (6). Les connaissances actuelles sur l'apoptose induite par le coronavirus sont limitées. L'apoptose induite par le SRAS-CoV a été décrite dans plusieurs tissus chez des patients infectés (7, 8) et il a été démontré que divers composants du SRAS-CoV déclenchent l'apoptose (9-11). Nous et d'autres avons démontré que le MERS-CoV déclenchait l'apoptose dans les cellules épithéliales pulmonaires humaines (12), les cellules T primaires humaines (13) et les cellules pulmonaires et rénales de ouistitis infectés par le MERS-CoV (14). Récemment, l'apoptose induite par le SRAS-CoV-2 a été détectée dans des cellules épithéliales trachéobronchiques humaines primaires infectées (15), des organoïdes alvéolaires humains (16), des poumons de hamsters infectés par le SRAS-CoV (17) et des échantillons de biopsie pulmonaire de patients atteints de coronavirus. Maladie 2019 (COVID-19) (18). Contrairement au SARS-CoV, le mécanisme de l'apoptose induite par le SARS-CoV-2 et le MERS-CoV reste largement inexploré. Malgré la détection fréquente de l'apoptose lors des infections par le SRAS-CoV-2, le SRAS-CoV et le MERS-CoV, le rôle de l'apoptose dans la pathogenèse de ces coronavirus hautement pathogènes est inconnu.
Dans la présente étude, en utilisant le MERS-CoV comme modèle des coronavirus hautement pathogènes, nous avons étudié la pertinence physiologique de l'apoptose dans la pathogenèse du MERS-CoV avec une combinaison de modèles in vitro, ex vivo et in vivo. Nous avons identifié la signalisation de la protéine kinase R-like endoplasmic reticulum kinase (PERK) comme un modulateur clé de l'apoptose déclenchée par le MERS-CoV. Nous avons en outre démontré que les signaux pro-apoptotiques en aval de la signalisation PERK convergaient au niveau de la voie de l'apoptose intrinsèque et que l'inhibition de la signalisation PERK ou de l'apoptose intrinsèque atténuait de manière significative la pathogenèse du MERS-CoV in vivo. L'inhibition de l'apoptose intrinsèque a également limité l'apoptose induite par le SRAS-CoV-2 et le SRAS-CoV in vitro et a nettement amélioré les lésions pulmonaires des souris enzyme de conversion de l'angiotensine humaine 2 (hACE2) inoculées par le SRAS-CoV-2. Collectivement, notre étude fournit des preuves de la contribution critique de l'apoptose dans la pathogenèse du coronavirus pathogène humain. Nos résultats révèlent en outre que l'apoptose peut être ciblée comme une stratégie d'intervention efficace dans le traitement des coronavirus hautement pathogènes, notamment le MERS-CoV et le SARS-CoV-2.
RÉSULTATS
L'infection par le MERS-CoV active la signalisation PERK
Le MERS-CoV a induit une apoptose dépendante de la caspase substantielle dans des explants pulmonaires humains ex vivo et dans les poumons de souris infectées à la dipeptidyl peptidase 4 (hDPP4), suggérant que l'apoptose pourrait jouer des rôles physiologiques critiques dans la pathogenèse du MERS-CoV (Fig. 1, A et B ). Pour obtenir des informations mécaniques sur l'apoptose induite par le MERS-CoV, nous avons interrogé le profil transcriptomique des cellules épithéliales bronchiques humaines Calu3 infectées par le MERS-CoV, qui contenaient 1411 et 3821 gènes différentiellement exprimés (DEG) à 12 et 24 heures après l'infection (hpi ), respectivement (14). L'annotation de l'ontologie génique (GO) des DEG sous le terme GO de « régulation positive de la mort cellulaire » a identifié 73 et 179 DEG potentielles associées à la mort cellulaire à 12 et 24 hpi, respectivement (tableau S1). L'analyse d'enrichissement GO fold réalisée à l'aide de cet ensemble de DEG associés à la mort cellulaire a démontré une surreprésentation des gènes impliqués dans le stress du réticulum endoplasmique (RE) et les catégories d'apoptose mitochondriale/intrinsèque (Fig. 1C et tableau S2). D'autres analyses des DEG supérieurs associés à la mort cellulaire ont révélé un enrichissement remarquable des gènes régulés par PERK parmi ces DEG supérieurs associés à la mort cellulaire (Fig. 1, D et E). Cette découverte a été soutenue par l'observation que PERK (également connu sous le nom d'EIF2AK3) était régulé à la hausse à 12 et 24 hpi (Fig. 1E). Pour explorer davantage l'implication potentielle de PERK dans la mort cellulaire induite par le MERS-CoV, nous avons utilisé la base de données Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING) pour créer un réseau d'interaction protéine-protéine (PPI) de la mort cellulaire. DEG associés en utilisant les gènes voisins les plus directs de PERK (19). Dans ce réseau PPI, nous avons identifié 117 nœuds et 618 arêtes, dont 45 gènes régulés à la hausse et 72 gènes régulés à la baisse, démontrant un rôle régulateur potentiel de PERK sur les DEG associés à la mort cellulaire lors d'une infection par MERS-CoV (Fig. 1F). Pour confirmer l'activation de la signalisation PERK lors de l'infection par le MERS-CoV, nous avons évalué l'expression du facteur de transcription activant 4 (ATF4) et de la protéine homologue C/EBP (CHOP), des facteurs de transcription régulés par la signalisation PERK, dans le modèle infecté par le MERS-CoV lignées cellulaires. Nos données ont montré que l'infection par le MERS-CoV régulait fortement à la hausse l'expression d'ATF4 et de CHOP dans les cellules Calu3 et Huh7 (Fig. 1, G à J). Nous avons ensuite examiné l'expression de facteurs régulés par PERK (20) représentatifs dans des cellules épithéliales humaines primaires des petites voies respiratoires infectées par le MERS-CoV. Nos données ont démontré que l'infection par le MERS-CoV régulait à la hausse de manière significative l'expression des facteurs de transcription régulés par PERK et des régulateurs associés à l'apoptose en aval (Fig. 1K). Collectivement, nos résultats suggèrent que l'infection par le MERS-CoV active la signalisation PERK, qui est potentiellement impliquée dans l'apoptose induite par le MERS-CoV.
Fig. 1 L'infection par le MERS-CoV active la signalisation PERK.(UNE) Tissus pulmonaires humains infectés par le MERS-CoV et (B) les poumons de souris hDPP4 inoculées au MERS-CoV ont été immunomarqués pour le MERS-CoV N, la caspase-3 clivée et le 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Cl-caspase-3, clivée-caspase-3. (C) Analyse d'enrichissement GO fold des DEG associés à la mort cellulaire montrant les 30 principaux processus biologiques enrichis avec P ré) Carte thermique démontrant les 40 principaux DEG associés à la mort cellulaire régulés à la hausse. Les gènes régulés par PERK ont été mis en évidence. (E) Tracés volcaniques des DEG associés à la mort cellulaire, qui ont été surlignés en rouge. Les gènes régulés par PERK ont été marqués. (F) Réseau PPI basé sur STRING de DEG associés à la mort cellulaire. La largeur de la bordure du nœud représentait la valeur P. Les DEG associés à la mort cellulaire ont été marqués avec des bordures vertes, et les DEG associés à la mort cellulaire régulés par PERK ont été marqués avec des bordures oranges. (g et H) Des cellules Calu3 et Huh7 infectées par le MERS-CoV ont été récoltées à 24 hpi pour une analyse RT-qPCR (n = 3 à 4). GAPDH, glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase. (je) Activité de rapporteur CHOP-Luc dans les cellules Huh7 infectées par le MERS-CoV (n = 3). (J) Expression CHOP dans les cellules Huh7 infectées par le MERS-CoV. (K) Expression de gènes régulés par PERK représentatifs dans des cellules épithéliales humaines primaires des petites voies respiratoires infectées par le MERS-CoV (n = 3). Les données représentées signifient ± SD du nombre indiqué de répétitions biologiques. Les différences statistiques ont été déterminées avec une analyse de variance à un facteur (ANOVA) en (G) à (I) et le test t de Student en (K). **P < 0,01 ; ***P < 0,001 ; ****P < 0,0001. Barres d'échelle, 50 m (A et B).
PERK est un régulateur principal de l'apoptose induite par le MERS-CoV
Avec l'enzyme 1 alpha nécessitant de l'inositol (IRE1α) et l'ATF6, PERK est l'un des trois principaux capteurs de la réponse protéique dépliée (UPR), qui participe à la régulation des fonctions cellulaires fondamentales, y compris la détermination du destin cellulaire (21). En particulier, l'activation persistante de PERK est connue pour déclencher l'apoptose (22). L'apoptose induite par le MERS-CoV a été significativement améliorée lors de l'épuisement du gène PERK (Fig. 2, A et B). En parallèle, l'inhibiteur de PERK GSK2656157 a considérablement réduit l'apoptose dans les cellules infectées par le MERS-CoV de manière dose-dépendante à l'échelle nanomolaire (Fig. 2, C et D). L'effet spécifique de l'inhibition de PERK a été encore validé avec un autre inhibiteur sélectif de PERK, AMG PERK 44, qui a également régulé à la baisse l'apoptose induite par le MERS-CoV (Fig. 2E). En tant que témoins, l'inhibition d'IRE1α n'a pas réduit l'apoptose induite par le MERS-CoV, suggérant que la voie PERK mais pas la voie IRE1α était spécifiquement responsable de la médiation de l'apoptose dans les cellules infectées par le MERS-CoV (Fig. 2F). L'activation de la voie PERK régit un répertoire de signaux de pro-mort qui convergent finalement vers la voie intrinsèque de l'apoptose (21, 23). Pour disséquer davantage le mécanisme de l'apoptose médiée par PERK lors d'une infection par le MERS-CoV, nous avons évalué l'expression des signaux de pro-mort régulés par PERK dans les cellules infectées avec ou sans inhibiteurs de PERK. Comme le montre la figure 2G, l'infection par le MERS-CoV a considérablement régulé à la hausse un groupe de signaux apoptotiques pro-intrinsèques régulés par la voie PERK, notamment BIM, ERO1α (endoplasmique du réticulum oxydoréductase 1 alpha), NOXA et PUMA (modulateur d'apoptose régulé à la hausse par p53). La suppression de la signalisation PERK avec des inhibiteurs sélectifs de PERK a significativement réduit l'expression de ces facteurs apoptotiques pro-intrinsèques (Fig. 2G). BIM, NOXA et PUMA sont des membres pro-apoptotiques de la famille des lymphomes à cellules B 2 (BCL-2) (24). Pour évaluer davantage leur implication dans l'apoptose induite par le MERS-CoV, nous avons traité les cellules Huh7 avec un petit ARN interférent (siRNA) ciblant ces gènes, suivi d'une infection par le MERS-CoV et évalué l'activation de l'apoptose à 48 hpi. Nos résultats ont démontré que les siRNA ciblant BIM, NOXA et PUMA réduisaient considérablement l'apoptose induite par le MERS-CoV (fig. S1), ce qui indiquait que ces membres pro-apoptotiques de la famille BCL-2 contribuaient à l'apoptose induite par le MERS-CoV. Conformément à ces résultats, l'inhibition de la caspase-9, la caspase initiatrice de l'apoptose intrinsèque, mais pas de la caspase-8, la caspase initiatrice de l'apoptose extrinsèque, a considérablement sauvé la viabilité des cellules infectées par le MERS-CoV (Fig. 2H). Ensemble, nos données démontrent un rôle essentiel de la signalisation PERK dans la médiation de l'apoptose induite par le MERS-CoV, principalement en engageant des signaux apoptotiques intrinsèques. L'apoptose est reconnue comme faisant partie de la défense innée de l'hôte, qui élimine les cellules infectées pour le bénéfice global de l'hôte. Néanmoins, de nombreux virus ont développé des stratégies qui exploitent la machinerie de l'apoptose pour faciliter leur réplication (25, 26). Pour évaluer si l'apoptose joue un rôle dans la réplication du MERS-CoV, nous avons surveillé la réplication du virus lors de l'inhibition de l'apoptose induite par PERK. Nos données ont montré que les inhibiteurs de PERK et l'épuisement génétique diminuaient de manière similaire la réplication du MERS-CoV (fig. S2, A à C). Nous avons ensuite ciblé directement la cascade d'apoptose et quantifié la réplication virale. Nos données ont montré que l'inhibiteur de l'apoptose z-VAD-fmk supprimait la réplication du MERS-CoV, tandis que l'étoposide inducteur de l'apoptose améliorait la réplication du virus (fig. S2, D à F). Les inhibiteurs de PERK et de caspase n'ont pas réduit l'entrée du pseudovirus MERS-CoV-spike (S), suggérant que la réduction observée de la réplication du virus n'était pas due à des différences dans l'entrée du virus (fig. S3). Collectivement, ces résultats démontrent que l'apoptose induite par le virus médiée par PERK peut augmenter la réplication du MERS-CoV.
Fig. 2 PERK est un régulateur principal de l'apoptose induite par le MERS-CoV.(UNE) Des cellules Huh7 traitées par PERK ou de petits ARN interférents brouillés (ARNsi) ont été infectées par le MERS-CoV. À 24 hpi, l'induction de l'apoptose a été quantifiée avec des tests d'activité caspase-3/7 (n = 3). MOI, multiplicité d'infection. (B) PERK ou des cellules Huh7 traitées par siRNA brouillées ont été infectées par le MERS-CoV à 1 MOI. À 24 hpi, le clivage de la caspase-3 a été évalué avec des Western blots. (C) Détection par transfert Western du clivage de la caspase-3 de cellules Huh7 infectées par le MERS-CoV traitées avec GSK2656157. (ré à F) Les cellules Huh7 ont été infectées par le MERS-CoV à 0,01 MOI et traitées avec GSK2656157 (D), AMG PERK 44 (E) ou 4μ8c (F) aux concentrations indiquées (n = 3 à 4). L'induction de l'apoptose a été quantifiée avec des tests d'activité caspase-3/7 à 24 hpi (n = 3). DMSO, diméthylsulfoxyde. (g) Expression de gènes apoptotiques prointrinsèques régulés par PERK dans des cellules Huh7 lors d'une infection par MERS-CoV avec un traitement GSK2657157 ou AMG PERK 44 (n = 3). (H) Les cellules Huh7 et Calu3 infectées par le MERS-CoV ont été traitées avec du DMSO, un inhibiteur de pan-caspase (z-VAD-fmk), un inhibiteur de caspase-8 (z-IETD-fmk) ou un inhibiteur de caspase-9 (z-LEHD-fmk ). La viabilité cellulaire à 24 hpi a été quantifiée (n = 4). Les données représentées signifient ± SD du nombre indiqué de répétitions biologiques. La différence statistique entre les groupes a été déterminée par ANOVA à un facteur et a été considérée comme significative lorsque P < 0,05. **P < 0,01 ; ***P < 0,001 ; ****P < 0,0001. ns, non statistiquement significatif.
L'inhibition de la signalisation PERK réduit considérablement l'apoptose dans les tissus pulmonaires humains infectés par le MERS-CoV
Ensuite, pour étudier la pertinence physiologique de l'apoptose médiée par PERK lors d'une infection par le MERS-CoV, nous avons récapitulé l'infection par le MERS-CoV dans des cultures de tissus pulmonaires humains ex vivo. En accord avec nos découvertes in vitro, l'infection par le MERS-CoV a activé la signalisation PERK dans les tissus infectés, et l'inhibition de la signalisation PERK a considérablement atténué la régulation à la hausse des gènes régulés par PERK, y compris un sous-ensemble de facteurs apoptotiques pro-intrinsèques [CHOP, BIM, TRIB3 (tribbles pseudokinase 3), NOXA, and ERO1α] (Fig. 3A). Avec la microscopie confocale, nous avons démontré que l'inhibition de PERK avec GSK2656157 a considérablement amélioré à la fois l'apoptose induite par le MERS-CoV et la propagation du virus dans les tissus pulmonaires humains infectés (Fig. 3, B et C). La suppression de la réplication virale par l'inhibition de PERK a été illustrée par l'immunohistochimie, la transcription inverse quantitative de la réaction en chaîne de la polymérase (RT-qPCR) et les tests de plaque (Fig. 3, D et E) et pourrait de même être obtenue avec l'inhibition de la caspase (fig. S4 ). Dans l'ensemble, les résultats des tissus pulmonaires humains ex vivo soutiennent que la signalisation PERK médie l'apoptose induite par le MERS-CoV, tandis que l'inhibition de la signalisation PERK supprime puissamment l'apoptose et la croissance du virus.
Fig. 3 L'inhibition de la signalisation PERK réduit considérablement l'apoptose dans les tissus pulmonaires humains infectés par le MERS-CoV.Des explants de tissus pulmonaires humains ont été infectés par le MERS-CoV avec un inoculum de 1 × 108 unités formatrices de plaques (PFU)/ml. L'inoculum a été retiré à 2 hpi et remplacé par des milieux de culture avec ou sans l'inhibiteur de PERK. Les échantillons ont été récoltés à 24 hpi. (UNE) Analyse RT-qPCR des gènes régulés par PERK dans les tissus pulmonaires humains (n = 4). (B) Images d'immunofluorescence représentatives de tissus pulmonaires humains infectés par le MERS-CoV traités avec GSK2656157 (en haut à droite) ou ont été simulés (en haut à gauche). Les images ont été immunomarquées pour la caspase-3 clivée (rouge) et le MERS-CoV N (vert). Le DAPI (bleu) a été utilisé pour identifier les noyaux cellulaires. (C) Analyses quantitatives de l'activation de la caspase-3 et des signaux MERS-CoV N des tissus pulmonaires humains infectés. Les résultats ont été présentés sous forme de boîtes à moustaches de la médiane ± du premier au troisième quartiles avec des moustaches étendues aux maxima et minima (n = 5 à 6). (ré) Images d'immunohistochimie représentatives de tissus pulmonaires humains infectés par le MERS-CoV. L'étendue de l'infection par le MERS-CoV a été identifiée avec la coloration MERS-CoV N (marron). (E) Quantification de la réplication virale par RT-qPCR et tests sur plages (n = 4). Les résultats ont été obtenus en utilisant des tissus pulmonaires humains de quatre à six donneurs indépendants, comme indiqué dans les panels respectifs. La différence statistique entre les groupes en (C) et (E) a été déterminée par ANOVA à un facteur ou le test t de Student, respectivement, et a été considérée comme significative lorsque P < 0,05. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001. Barres d'échelle, 50 um (B).
Pour disséquer si l'apoptose a joué un rôle dans la pathogenèse du MERS-CoV in vivo, nous avons étudié l'effet de l'inhibition de PERK chez des souris transgéniques hDPP4 lors d'une provocation létale MERS-CoV (Fig. 4A). Nous avons détecté l'expression de 14 gènes représentatifs régulés par PERK dans les poumons de souris récoltés les jours 2 et 4 après l'épreuve. Nos données ont montré que 12 des 14 (85,7%) gènes évalués, y compris un sous-ensemble de gènes spécifiquement impliqués dans l'apoptose intrinsèque, étaient significativement régulés à la hausse après l'épreuve (Fig. 4B et Fig. S5A). L'expression de 11 (Atf4, Chop, Bim, Noxa, Puma, Gadd34, Sesn2, Chac1, Atf3, Atf5 et Dr5) des 12 gènes régulés à la hausse a été significativement atténuée par l'inhibition de PERK le jour 2 ou 4 ou les deux après l'épreuve. Une pneumonie hémorragique grave et des lésions alvéolaires diffuses étaient les caractéristiques histopathologiques prédominantes dans les cas graves et mortels de MERS (27). Pendant ce temps, des changements morphologiques ont laissé entendre la présence d'apoptose dans les tissus pulmonaires humains infectés par le MERS-CoV, ce qui pourrait contribuer à des lésions pulmonaires (28). Nos résultats chez les souris transgéniques hDPP4 infectées ont démontré que la régulation négative des gènes apoptotiques régulés par PERK entraînait une réduction marquée de l'étendue de l'apoptose, comme l'a révélé la coloration par immunofluorescence de l'activation de la caspase-3 dans les poumons de souris (fig. S5, B et C). De plus, les examens histologiques ont indiqué que l'inhibition de la signalisation PERK améliorait considérablement les lésions pulmonaires induites par le MERS-CoV (Fig. 4, C à F). Les souris traitées au diméthylsulfoxyde (DMSO) ont montré un épaississement marqué des cloisons alvéolaires à travers le poumon (têtes de flèches jaunes) avec une infiltration sévère de cellules inflammatoires mononucléées (flèches vertes) le jour 2 après l'épreuve (Fig. 4, C et G). Au jour 4 après l'épreuve, une hémorragie étendue (flèches vertes) dans les alvéoles et les dépôts de fibrine (pointes de flèche jaunes) ont été détectées dans plusieurs zones du poumon de souris infecté (Fig. 4, E et G). Cependant, en comparaison avec leur compagnon de portée traité au DMSO, les souris traitées au GSK2656157 n'ont présenté qu'une légère infiltration inflammatoire dans les septa alvéolaires aux jours 2 et 4 après l'épreuve (Fig. 4, D, F et G). En plus de ces résultats histologiques, l'inhibition de la signalisation PERK in vivo a supprimé de manière significative la réplication du MERS-CoV dans les poumons des souris infectées au jour 4 après l'épreuve (Fig. 4H). Alors que toutes les souris traitées au DMSO ont succombé à l'infection par le MERS-CoV, la survie des souris traitées au GSK2656157 a été significativement améliorée (survie au jour 14 des souris traitées au DMSO : 0 sur 16 ou 0 % contre GSK2656157 : 8 sur 22 ou 36,4 % ; P = 0,0020) (Fig. 4, I et J). En plus des souris transgéniques hDPP4, nous avons également évalué l'impact de l'apoptose dans la pathogenèse du MERS-CoV chez les souris hDPP4 exon 10 à 12 knockin (KI). Dans ce modèle, l'inhibiteur sélectif de PERK AMG PERK 44 a considérablement réduit la pathologie pulmonaire et la charge virale (Fig. 4, K et L) et a amélioré la survie des souris hDPP4 KI infectées par le MERS-CoV (MERS-CoVMA) de 16,7 % (1 sur 6) à 58,3 % (7 sur 12) (P = 0,0350) (Fig. 4, M et N). Ensemble, nos résultats démontrent que l'apoptose régulée par PERK contribue à la pathogenèse du MERS-CoV. L'intervention avec des inhibiteurs spécifiques de PERK améliore considérablement l'apoptose induite par le virus, atténue les lésions pulmonaires et améliore l'issue de la maladie du MERS.
Fig. 4 Les inhibiteurs de PERK améliorent le résultat de l'infection des souris transgéniques et KI inoculées par le MERS-CoV hDPP4.(UNE) Illustration schématique de l'expérimentation animale. (B) L'expression de gènes régulés par PERK représentatifs a été évaluée par RT-qPCR (n = 4). (C à F) Images représentatives de la tache d'hématoxyline et d'éosine (H&E) des poumons de souris récoltés. (C) Des cloisons alvéolaires épaissies (pointes de flèches jaunes) et une inflammation septale alvéolaire sévère par des cellules mononucléées (flèches vertes) ont été détectées au jour 2 après l'épreuve. (E) De grandes zones d'hémorragie dans les sacs alvéolaires (flèches vertes) et des dépôts de fibrine (pointes de flèches jaunes) ont été détectées au jour 4 après l'épreuve. (D et F) Les souris traitées au GSK2656157 n'ont subi qu'une légère infiltration inflammatoire. (g) Analyses quantitatives de la pathologie pulmonaire (n = 6). (H) Copies du génome viral des poumons récoltés (n = 5). (je et J) Survie et poids corporel des souris infectées. (K) Analyses quantitatives de la pathologie pulmonaire et (L) copies du génome viral de souris hDPP4 KI inoculées par MERS-CoVMA (n = 3). (M et N) Survie et poids corporel de souris hDPP4 KI inoculées par MERS-CoVMA et traitées avec AMG PERK 44 ou DMSO. Les différences statistiques ont été déterminées avec une ANOVA bidirectionnelle dans (B), une ANOVA unidirectionnelle dans (G) et (K), le test t de Student dans (H) et (L), ou le test du log-rank (Mantel-Cox) dans (I) et (M). *P UNE) Les cellules Huh7 infectées par le SRAS-CoV-2 ou le SRAS-CoV ont été traitées avec du z-LEHD-fmk ou du DMSO. Les lysats cellulaires ont été récoltés à 24 hpi pour des tests d'activité caspase-3/7 (n = 3). RLU, unité de lumière relative. (B) Des souris hDPP4 KI ont été inoculées par voie intranasale avec 2500-PFU MERS-CoVMA. Les souris ont reçu une injection intrapéritonéale de z-LEHD-fmk ou de DMSO aux jours indiqués. (C) La survie a été surveillée pendant 14 jours. (ré) Des souris transgéniques hACE2 ont été inoculées par voie intranasale avec 2,5 × 104-PFU SARS-CoV-2. Les souris ont reçu une injection intrapéritonéale de z-LEHD-fmk ou de DMSO aux jours indiqués. Des échantillons de poumons ont été récoltés au jour 3 après l'épreuve. (E) La pathologie pulmonaire des souris hACE2 inoculées par le SRAS-CoV-2 avec un traitement z-LEHD-fmk ou DMSO a été évaluée avec la coloration H&E. La zone encadrée a été imagée et présentée à un grossissement plus élevé. (F) Le niveau d'expression des cytokines pro-inflammatoires a été déterminé par qPCR (n = 4). Les résultats en (A) et (F) ont été obtenus en utilisant trois à quatre échantillons biologiquement indépendants, comme indiqué dans les panneaux respectifs. La différence statistique entre les groupes a été déterminée avec un test ANOVA à sens unique dans (A) et (F) ou le test du log-rank (Mantel-Cox) dans (C) et a été considérée comme significative lorsque P < 0,05. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001 ; ****P < 0,0001. Barres d'échelle, 500 m (vue agrandie) et 100 m (en médaillon) (E). TNFα, facteur de nécrose tumorale–α ; IL-6, interleukine-6; IP10, protéine induite par l'interféron gamma 10.
La protéine membranaire MERS-CoV déclenche l'apoptose en activant la signalisation PERK
Ensuite, nous avons cherché à identifier le composant MERS-CoV qui a activé la signalisation PERK. Nous avons récemment démontré que le MERS-CoV inactivé par les ultraviolets restait capable d'induire l'apoptose, ce qui implique que les composants structurels du MERS-CoV pourraient médier l'apoptose (13). En conséquence, nous avons évalué les quatre composants structurels du MERS-CoV sur leur capacité à initier l'activation de PERK. Nos résultats ont démontré que la protéine membranaire (M) du MERS-CoV activait spécifiquement la signalisation PERK, comme en témoigne l'expression accrue d'ATF4 et de CHOP (Fig. 6A). Conformément à cette découverte, notre résultat du test de clivage de la caspase-3/7 a démontré que le MERS-CoV M mais pas S, l'enveloppe (E) ou N, déclenchait de manière significative l'apoptose (Fig. 6B), ce qui a été en outre vérifié par le détection du clivage de la caspase-3 avec des Western blots (Fig. 6C). L'apoptose déclenchée par le MERS-CoV M pourrait être détectée de manière cohérente au fil du temps (Fig. 6D) d'une manière dose-dépendante (Fig. 6E) et peut être atténuée avec un inhibiteur pan-caspase (Fig. 6F) ou un inhibiteur sélectif de PERK (Fig. 6G). Ainsi, nos données indiquent que le MERS-CoV M est un déterminant viral majeur de l'apoptose médiée par PERK.
Fig. 6 La protéine MERS-CoV M déclenche l'apoptose en activant la signalisation PERK.(UNE) Les cellules Huh7 exprimant MERS-CoV S–, E–, M– ou N ont été récoltées à 24 hpi. Des expressions géniques représentatives pour les voies PERK (ATF4 et CHOP), IRE1α (sXBP1/tXBP1 et ERdj4) et ATF6 (Hyou1 et HerpUD) ont été déterminées (n = 3). sXBP1/tXBP1 représentait le rapport de la forme épissée de XBP1 sur le total de XBP1. (B) L'activation de l'apoptose par l'expression du MERS-CoV M dans les cellules Huh7 a été quantifiée avec des tests d'activité caspase-3/7 (n = 3). (C) Le clivage de la caspase-3 dans les cellules Huh7 exprimant le MERS-CoV M a été détecté avec des Western blots. (ré) L'activation de l'apoptose par l'expression du MERS-CoV M dans les cellules Huh7 à 12, 24 et 48 hpi a été quantifiée avec des tests d'activité caspase-3/7 (n = 4). (E) L'induction dose-dépendante de l'apoptose par le MERS-CoV M a été analysée par détection par Western blot du clivage de la caspase-3. (F et g) Les cellules Huh7 transfectées par le MERS-CoV M ont été traitées avec l'inhibiteur de la pan-apoptose z-VAD-fmk (F) ou l'inhibiteur PERK GSK2656157 (G). Le clivage de la caspase-3 a été détecté par Western blots. Les données représentées signifient ± SD du nombre indiqué de répétitions biologiques. La différence statistique entre les groupes a été déterminée par ANOVA à un facteur et a été considérée comme significative lorsque P < 0,05. ****P < 0,0001.
Le MERS-CoV M déclenche l'activation de PERK en déplaçant PERK de GRP78
Pour élucider davantage le mécanisme de la façon dont le MERS-CoV M active la signalisation PERK, nous avons évalué la distribution cellulaire du MERS-CoV M. Le MERS-CoV M exprimé de manière exogène est fortement colocalisé avec le marqueur ER GRP78. Le MERS-CoV M a semblé interagir et redistribuer le GRP78 dans une région périnucléaire (Fig. 7A). En revanche, la redistribution de GRP78 n'a pas été détectée dans les cellules exprimant le vecteur ou le MERS-CoV nucléocapside (N) (Fig. 7A). Le MERS-CoV M n'a pas colocalisé ou perturbé la distribution d'un autre marqueur du RE, la protéine disulfure isomérase (PDI), suggérant que l'interaction entre le MERS-CoV M et le GRP78 était spécifique (Fig. 7B). Contrairement à M surexprimé qui reste dans les compartiments périnulaires, les protéines M des cellules infectées par le coronavirus interagissent avec d'autres composants viraux et se dirigent vers la périphérie cellulaire à mesure que la sortie du virus augmente (29, 30). Dans les cellules infectées par le MERS-CoV ou les tissus pulmonaires humains, le GRP78 s'est également colocalisé avec le MERS-CoV M et a été plus facilement détecté dans les régions périphériques des cellules infectées (Fig. 7, C et D). Le GRP78 est le régulateur principal du stress du RE et régit l'UPR. Dans les cellules physiologiquement saines, PERK est maintenu dans un état inactivé en se liant au GRP78. Dans des conditions de stress, PERK est dissocié du GRP78, suivi d'une oligomérisation, d'une autophosphorylation et d'une activation (31). Sur la base de la colocalisation entre MERS-CoV M et GRP78, nous avons postulé que MERS-CoV M pourrait se lier à GRP78 et perturber l'interaction entre GRP78 et PERK, entraînant l'activation de PERK. Pour répondre à cette possibilité, nous avons d'abord analysé l'interaction entre le MERS-CoV M et le GRP78. En utilisant la co-immunoprécipitation, nos données ont montré que le MERS-CoV M mais pas N pouvait se lier physiquement au GRP78 (Fig. 7E). L'interaction entre GRP78 et PERK a été nettement réduite en présence de MERS-CoV M (Fig. 7F), suggérant que la liaison entre MERS-CoV M et GRP78 a perturbé l'association entre GRP78 et PERK. La protéine M du coronavirus est essentielle à la formation des particules (30, 32). Des mutations dans chacun des différents domaines de la protéine atténuent considérablement l'assemblage du virus (33, 34). Pour disséquer le domaine spécifique qui était responsable de l'induction de l'apoptose, nous avons construit des mutants M avec des délétions séquentielles du domaine transmembranaire individuel (Fig. 7G). Nous avons ensuite surexprimé les mutants M ou M de type sauvage et quantifié le niveau d'induction de l'apoptose avec des Western blots ou des tests d'activité caspase-3/7. Nos résultats ont indiqué que si le mutant M M∆TM1 conservait la capacité d'induire l'apoptose, M∆TM12 ou M∆TM123 ne déclenchaient plus l'apoptose, ce qui suggère que le domaine transmembranaire 2 de la protéine M est responsable de l'induction de l'apoptose (Fig. 7, H et I). Dans l'ensemble, nos résultats démontrent que le MERS-CoV M déclenche l'apoptose en activant la signalisation PERK en dissociant GRP78 de PERK (fig. S7).
Fig. 7 MERS-CoV M déclenche l'activation de PERK en déplaçant PERK de GRP78.(UNE et B) The cellular localization of exogenously expressed MERS-CoV M or N protein and GRP78 was determined with confocal microscopy. (C et D) The cellular localization of MERS-CoV M and GRP78 in infected Huh7 cell (C) or human lung tissue (D) was determined with confocal microscopy. (E) 293 T cells were transfected with MERS-CoV M and GRP78-V5. At 48 hours after transfection, the cells were lysed and immunoprecipitated with an anti-V5 antibody. The presence of coimmunoprecipitated M protein was determined with Western blots. (F) 293 T cells were transfected with PERK- and GRP78-expressing plasmids with or without MERS-CoV M. At 48 hours after transfection, the cells were lysed and immunoprecipitated against GRP78-V5. The presence of coimmunoprecipitated PERK was determined with Western blots. (g) Schematic of M mutants with sequential transmembrane domain deletions. (H et je) M and M mutants were expressed in Huh7 cells and were harvested at 48 hours after transfection. Apoptosis induction was evaluated with Western blots (H) or caspase-3/7 activity assays (I) (n = 3). Data represented means ± SD from three independent experiments. Statistical difference between groups in (I) was determined with one-way ANOVA and was considered significant when P < 0.05. ****P < 0.0001. Scale bars, 10 μm (A to D). aa, amino acids.
DISCUSSION
Infections by highly pathogenic coronaviruses including SARS-CoV-2, MERS-CoV, and SARS-CoV result in substantial apoptosis in infected cells and tissues. However, the physiological relevance of apoptosis in the pathogenesis of human pathogenic coronaviruses is unknown. Here, by using MERS-CoV as a model, we investigated the mechanism of MERS-CoV–induced apoptosis and determined the physiological relevance of apoptosis in MERS pathogenesis with a combination of in vitro, ex vivo, and in vivo models. We identified PERK signaling as the key regulator of the proapoptotic mediators in MERS-CoV infection, which converged in the intrinsic apoptosis pathway. Inhibition of PERK signaling or intrinsic apoptosis both attenuated MERS pathogenesis in vivo. Inhibition of intrinsic apoptosis similarly suppressed SARS-CoV-2– and SARS-CoV–induced apoptosis in vitro and ameliorated the lung damage in SARS-CoV-2–infected hACE2 mice. Together, our results demonstrate that apoptosis contributes to the pathogenesis of human pathogenic coronaviruses and that this process can be targeted to attenuate disease severity.
Considerable evidence suggests that apoptosis of the alveolar epithelium contributes to lung injury (6). During virus infections, while apoptosis serves to eliminate infected cells to limit virus propagation, the exacerbated apoptotic response may impair epithelial integrity, leading to barrier disruption and unfavorable outcomes. In influenza virus infections, virus-induced apoptosis has been thoroughly investigated and is considered predominantly proviral and lung destructive (35, 36). In contrast, despite the fact that apoptosis was documented in SARS-CoV-2, SARS-CoV, and MERS-CoV infections, its physiological role during the infection of human pathogenic coronaviruses has never been addressed. In this regard, our report provides clear evidence that virus-induced apoptosis contributes to lung damage and increases pathogenicity in human pathogenic coronavirus infection.
The precise proapoptotic pathway operative during MERS-CoV infection is largely unknown. Here, we demonstrate that MERS-CoV–induced apoptosis was regulated by PERK signaling, which was previously implicated in apoptosis induced by infectious bronchitis virus, a gammacoronavirus (37). MERS-CoV infection resulted in the up-regulated expression of PERK-regulated effectors including CHOP, BIM, NOXA, and PUMA, which are key activators of the intrinsic apoptosis pathway. In line with these findings, an intrinsic apoptosis inhibitor rescued the viability of MERS-CoV–infected cells and MERS-CoV–inoculated hDPP4 KI mice. Together, our data are congruous with the notion that PERK-governed apoptosis during MERS-CoV infection is not mediated through a single signal but is orchestrated through a repertoire of diverse mechanisms that ultimately converge on the intrinsic apoptosis pathway. Apoptosis induced by SARS-CoV-2 and SARS-CoV was similarly attenuated by the intrinsic apoptosis inhibitor in vitro. At the same time, treatment with the intrinsic apoptosis inhibitor markedly ameliorated the lung damage in SARS-CoV-2–inoculated hACE2 transgenic mice. These findings further indicate that apoptosis inhibition should be investigated as a potential therapeutic strategy in treating the highly pathogenic coronaviruses.
Multiple SARS-CoV components are capable of triggering apoptosis (9–11). SARS-CoV-2 open reading frame 3a (ORF3a) was recently suggested to induce apoptosis through inducing the release of mitochondrial cytochrome c (38). However, the viral component of MERS-CoV that initiates apoptosis remains unknown. Here, our results indicated MERS-CoV M as a key viral determinant of PERK-mediated apoptosis. MERS-CoV M displaced the negative regulator of UPR, GRP78, from binding to PERK, leading to PERK activation. The M protein of coronaviruses is the most abundant structural protein constituting the overall scaffold of the virus and plays an indispensible role during virus assembly (30). Stringent requirements must be satisfied for proper M functions during virus assembly, and mutations in any domain of the protein result in attenuated particle formation (33). The M proteins of SARS-CoV (39) and MERS-CoV (40) are also interferon (IFN) antagonists in addition to their roles in virus assembly. Together, MERS-CoV M appears to be a multifaceted viral protein, serving as an essential structural component while modulating virus pathogenesis via inducing apoptosis and inhibiting the IFN response.
The finding that MERS-CoV–induced apoptosis can benefit virus replication is intriguing. Apoptosis is a strategy commonly adopted by the host to eliminate virus-infected cells. To successfully propagate within the host, many viruses have evolved mechanisms to evade apoptosis (5, 41), while other viruses including influenza viruses have developed strategies to exploit the apoptosis machinery for virus replication (25, 26, 42). We demonstrated here that inhibiting MERS-CoV–induced apoptosis would subsequently diminish virus replication. It is possible that the activated caspase cascade during apoptosis induction may activate certain host pathways that are required for efficient virus replication (42). Alternatively, direct caspase cleavage of the viral genome may augment the productive viral life cycle. In both cases, targeting apoptosis may provide dual benefits against MERS-CoV infection.
Our study has a number of limitations. First, the level of apoptosis induction between MERS-CoV, SARS-CoV-2, and SARS-CoV was not evaluated in parallel. Second, the capacity of apoptosis induction by the viral gene products of the three viruses was not compared. Mortality rate differs substantially between the three highly pathogenic coronaviruses including MERS-CoV (~35%), SARS-CoV-2 (~2%), and SARS-CoV (~10%). Knowledge on the relative extent of apoptosis induction between the three viruses and the viral gene products involved may promote our understanding on the pathogenic mechanisms of these human pathogenic coronaviruses. Overall, our study highlights the unfavorable contribution of apoptosis in the pathogenesis of human pathogenic coronaviruses and indicates apoptosis inhibition as a potential therapeutic strategy in the treatment of COVID-19 and MERS.
MÉTHODES
Cell lines and human small-airway epithelial cells
Huh7, 293 T, and VeroE6 cells were maintained in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, Gibco) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) (Gibco), penicillin (100 U/ml) Gibco), and streptomycin (100 μg/ml) (Gibco). Calu3 cells were cultured in DMEM/F-12 (Gibco) supplemented with 10% FBS, penicillin (100 U/ml), and streptomycin (100 μg/ml). Primary human small-airway epithelial cells were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC) and cultured with the airway epithelial cell basal medium supplemented with a bronchial epithelial cell growth kit (ATCC).
Virus
MERS-CoV (GenBank : JX869059.2) was a gift from R. Fouchier (Erasmus Medical Center, Rotterdam, The Netherlands). The MERS-CoVMA was a gift from P. McCray (University of Iowa, IA, USA). SARS-CoV-2 HKU-001a (GenBank accession number MT230904) was isolated from the nasopharyngeal aspirate of a patient with laboratory-confirmed COVID-19 in Hong Kong (43). SARS-CoV GZ50 (GenBank accession number AY304495) was an archived clinical isolate at the Department of Microbiology, The University of Hong Kong (HKU). All viruses were propagated and titered in VeroE6 cells with plaque assays as previously described (43). All experiments involving infectious MERS-CoV, SARS-CoV-2, and SARS-CoV followed the approved standard operating procedures of our Biosafety Level 3 facility at the Department of Microbiology, HKU.
Ex vivo human lung tissues
Preparation and infection of ex vivo human lung tissues were performed as we previously described (44). Briefly, human lung tissues for ex vivo studies were retrieved from patients underwent surgical operations at the Queen Mary Hospital, Hong Kong. All donors gave written consent as approved by the Institutional Review Board of HKU/Hospital Authority Hong Kong West Cluster. Normal nonmalignant lung tissue fragments that were in excess for the clinical diagnosis were used. The freshly obtained lung tissues were processed into small rectangular pieces and were rinsed with the primary tissue culture medium, which contained the advanced DMEM/F-12 medium supplemented with 2 mM Hepes (Gibco), 1× GlutaMAX (Gibco), penicillin (100 U/ml), streptomycin (100 μg/ml), vancomycin (20 μg/ml), ciprofloxacin (20 μg/ml), amikacin (50 μg/ml), and nystatin (50 μg/ml). The specimens were infected with MERS-CoV at a titer of 1 × 108 plaque-forming units (PFU)/ml. After 2 hours, the inoculum was removed, and the specimens were washed thoroughly with the primary tissue culture medium. The infected specimens were then transferred to inserts of 12-well Transwells (Corning) precoated with 60% Matrigel (Corning) diluted with the primary tissue culture medium. Subsequently, additional Matrigel mixture was added to the insert to seal the explant. The basolateral compartment was filled with primary tissue culture medium supplemented with 2.5 μM GSK2656157 dissolved in DMSO or DMSO only. The lung tissues were harvested at 24 hpi with either 10% neutral-buffered formalin for immunofluorescence staining or with RL lysis buffer for RT-qPCR analysis.
hDPP4 and ACE2 mouse models
The use of animals was approved by the Committee on the Use of Live Animals in Teaching and Research of HKU. The in-house developed hDPP4 transgenic mice were previously described (45). The hDPP4 transgenic mice was inoculated with 40-PFU MERS-CoV prediluted in 20 μl of phosphate-buffered saline (PBS) by intranasal injection, followed by intraperitoneal injection with GSK2656157 (25 mg/kg per day) (Merck) for 6 days or until sample harvest. The hDPP4 exon 10 to 12 KI mice were provided by P. McCray (University of Iowa, IA, USA) and were previously described (46). Littermates of the same sex were randomly assigned to experimental groups. On the day of infection, the mice were intranasally inoculated with 2500-PFU MERS-CoVMA. Infected mice were treated with AMG PERK44 (25 mg/kg per day) (Tocris) or z-LEHD-fmk (12.5 mg/kg per day) (SelleckChem) for 5 days. For SARS-CoV-2 infection, heterozygous K18-hACE2 transgenic mice, 2B6.Cg-Tg (K18-ACE2) 2Prlmn/J, were obtained from the Jackson laboratory and was previously described (47). Littermates of the same sex were randomly assigned to experimental groups. Mice were intranasally inoculated with 2.5 × 104–PFU SARS-CoV-2 and were intraperitoneally treated with z-LEHD-fmk (12.5 mg/kg per day) until sample harvest on day 3 after virus challenge. The health status and weight of the mice were monitored for 14 days on a daily basis or until the animal is sacrificed or euthanized because of reaching the humane end point of the experiment. Mice were euthanized at designated time points, and lung tissue from both treatment and control group mice were harvested for immunofluorescence staining, histopathology examination, or RT-qPCR analysis.
Antibodies
MERS-CoV N was detected with the in-house guinea pig anti–MERS-CoV N serum. MERS-CoV S was detected with the in-house mouse anti–MERS-CoV S immune serum. MERS-CoV M and SARS-CoV-2 M were detected with in-house mouse anti–MERS-CoV M and mouse anti–SARS-CoV-2 M immune serum, respectively. SARS-CoV M was detected with a rabbit anti–SARS-CoV M antibody from Rockland. Primary antibodies including rabbit anti–caspase-3, rabbit anti-PERK, rabbit anti-GRP78, and mouse anti-His were from Abcam. The mouse anti-CHOP antibody was from Cell Signaling Technology. The mouse anti-GRP78 was from R&D Systems. The mouse anti–β-actin was from Sigma-Aldrich. The V5-tagged proteins were detected with a mouse anti-V5 antibody from Immunoway. Secondary antibodies including Alexa Fluor 488 goat anti–guinea pig, Alexa Fluor 488 goat anti-mouse, and Alexa Fluor 568 donkey anti-rabbit were from Thermo Fisher Scientific. The goat anti-mouse horseradish peroxidase (HRP), goat anti-rabbit HRP, and goat anti–guinea pig antibodies from Thermo Fisher Scientific were used for Western blots and immunohistochemistry staining.
PERK, apoptosis, and other chemical modulators
Selective PERK inhibitors GSK2656157 and GSK2606414 were obtained from MedChemExpress, and AMG PERK 44 was obtained from Tocris Bioscience. The IRE1α inhibitor 4μ8c was obtained from Sigma-Aldrich. The pan-caspase inhibitor z-VAD-fmk was obtained from Invivogen. The caspase-8 inhibitor z-IETD-fmk and the caspase-9 inhibitor z-LEHD-fmk were purchased from R&D Systems. The apoptosis enhancer etoposide was obtained from Sigma-Aldrich. The UPR inducer tunicamycin was obtained from Tocris Bioscience.
Plasmids
MERS-CoV viral mRNA was purified from infected cell lysates using the RNeasy Kit (Qiagen) and reverse-transcribed with the Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche). MERS-CoV E, M, and N genes were PCR-amplified with specific primers and flanked at 5′ with Eco RI and 3′ with a 6× His tag, followed by Not I. The PCR products were digested with Eco RI and Not I, gel-purified, and cloned into the eukaryotic expression plasmid pCAGEN, resulting in pCAGEN-MERS-CoV-E-His, pCAGEN-MERS-CoV-M-His, and pCAGEN-MERS-CoV-N-His. The pCAGEN-MERS-CoV-M-His served as the template for cloning the M mutants including pCAGEN-MERS-CoV-M∆TM1, pCAGEN-MERS-CoV-M∆TM12, and pCAGEN-MERS-CoV-M∆TM123.
Transcriptome analysis
org/) (19) was used to create a PPI network of the cell death–associated DEGs using the most direct neighboring genes of PERK at 12 hours upon MERS-CoV infection. Cytoscape (version 3.7.0, www.cytoscape.org/) was used to analyze and visualize the interactions of the PPI network.
CHOP-Luc reporter assay
Dual-luciferase reporter assay was performed with the Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). Briefly, Huh7 cells were first cotransfected with the reporter plasmid pCHOP-Luc and the internal control plasmid pRL-SV40, followed by MERS-CoV infection at 1 multiplicity of infection (MOI). At 24 hpi, the infected cell lysates were harvested, and relative luciferase activity was determined by normalizing the relative luciferase unit readout of the firefly luciferase to that of the Renilla luciferase activity measured by the Vector X3 multilabel plate reader (PerkinElmer). Tunicamycin (1 μg/ml)–treated cells were used as a positive control.
Pseudovirus entry assay
MERS-CoV-S pseudovirus was generated using a protocol that we previously described (48). To evaluate the effect of PERK (GSK2656157 and AMG PERK 44) and caspase (z-VAD-fmk, z-IETD-fmk, and z-LEHD-fmk) inhibitors on MERS-CoV-S pseudovirus entry, Huh7 cells were treated with the inhibitors for 1 hour before inoculating with the MERS-CoV-S pseudoviruses. The inoculum was removed, and cells were washed at 2 hours after inoculation. At 24 hours after inoculation, the cells were lysed for detection of luciferase signal with a luciferase assay system (Promega).
Coimmunoprecipitation
Briefly, cells were lysed on ice with assay coimmunoprecipitation (RIPA co-IP) buffer [50 mM tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, and 1% NP-40 (pH 7.4)] containing 1× protease inhibitor cocktail (Roche) and 1× phosphatase inhibitor (Thermo Fisher Scientific). The lysates were incubated with primary antibodies at room temperature for 2 hours. Protein A/G beads (Bio-Rad) were then washed with the RIPA-co-IP buffer and added into the cell lysates for overnight incubation at 4°C. After the incubation, beads were washed five times with the RIPA-co-IP buffer and eluted in 1× SDS–polyacrylamide gel electrophoresis loading buffer by heating at 95°C for 10 min. The presence of immunoprecipitated protein in the eluent was detected with Western blots.
Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-qPCR)
Cells were lysed in RL buffer and extracted with the MiniBEST Universal RNA Extraction Kit (TaKaRa). Viral RNA in the supernatant was extracted with the MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit (TaKaRa). RT and qPCR were performed with Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit and LightCycler 480 master mix from Roche as we previously described (49). Primers and probes used in RT-qPCR reactions were listed in table S3. Human gene expression was normalized to human glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase mRNA, whereas the mouse gene expression was normalized to mouse β-actin mRNA. Fold change in gene expression was quantified using the ΔΔCt method.
Caspase and cell viability assays
The Caspase-Glo-3/7 assay (Promega) was used to quantify the activation of executor caspases including caspase-3 and caspase-7. Cells were lysed with the Caspase-Glo-3/7 reagent at the designated time points and were incubated at room temperature for 20 min, followed by measuring the luminescence signal with the Vector X3 multilabel plate reader (PerkinElmer). Cell viability was quantified with the CellTiter-Glo assay (Promega). Cells were lysed together with culture supernatant at a 1 :1 ratio (volume) with the CellTiter-Glo reagent and were incubated at room temperature for 10 min, followed by measuring the luminescence signal with the Vector X3 multilabel plate reader (PerkinElmer).
siRNA knockdown
SMARTpool ON-TARGETplus human PERK siRNA and ON-TARGETplus nontargeting pool siRNA were obtained from Dharmacon. Transfection of siRNA was performed using Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific). Briefly, the cells were transfected with 70 nM siRNA for two consecutive days. At 24 hours after the second siRNA transfection, the cells were counted and harvested in RIPA buffer for Western blots. In parallel, siRNA-transfected cells were challenged with MERS-CoV at 0.1 or 1 MOI for 1 hour at 37°C. Following virus inoculation, the cells were washed with PBS and incubated in DMEM for 24 hours. At 24 hpi, the cells were lysed for Western blot analysis or for caspase-3/7 assays.
Immunofluorescence staining
After fixation for 24 hours in 10% neutral-buffered formalin, the human and mice lung tissues were processed with a TP1020 Leica semienclosed benchtop tissue processor with serially increasing concentration of ethanol, xylene, and wax for 16 hours. Processed tissues were embedded with paraffin and sectioned at 5 μm with a Thermo Fisher Scientific HM 355S rotary microtome. Tissue sections were fished and dried to fix on Thermo Fisher Scientific Superfrost Plus slides at 37°C overnight before deparaffinizing and immunofluorescence staining. Antigen retrieval was performed by heating the slides in the antigen unmasking solution (Vector Laboratories) in a pressure cooker for 90 s. MERS-CoV was detected with an in-house polyclonal guinea pig anti-N serum. Caspase-3 activation was detected with a rabbit anti–caspase-3 antibody from Abcam. For the MERS-CoV M–transfected Huh7 cells, the localization of M protein was identified with an anti-His antibody from Abcam. Rabbit anti-PDI and rabbit anti-GRP78 antibodies were obtained from Abcam. Cell nuclei were labeled with the 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) nucleic acid stain from Thermo Fisher Scientific. Alexa Fluor secondary antibodies were obtained from Thermo Fisher Scientific. Mounting was performed with the ProLong Diamond Antifade mountant from Thermo Fisher Scientific. Images were acquired with confocal microscopy using a Zeiss LSM780 system with the 20× or the 40× oil immersion objective. Image fields were selected and processed with the ZEN software black edition (Zeiss) at the resolution of 1024 × 1024 pixels. To quantify the fluorescence intensity, representative images from multiple human or mouse lungs were split into separate channels, and the integrated intensity of channel 488 and 561 nm was quantified with ImageJ.
Histology and immunohistochemistry staining
Fixed mouse and human tissues were processed, embedded, and cut to prepare 5-μm tissue sections on glass slides. Slides were dewaxed with xylene and serially decreased concentrations of ethanol before staining. For hematoxylin and eosin (H&E) staining, tissue sections were stained with Gill’s H&E Y (Thermo Fisher Scientific) as we previously described (50). To detect the MERS-CoV N protein, tissue sections underwent the same antigen retrieval procedures as that of immunofluorescence staining, followed by blocking with 0.3% hydrogen peroxide for 30 min to abolish the activity of any potential endogenous peroxidase. Slides were sequentially incubated with the guinea pig anti-N serum and HRP-conjugated goat anti–guinea pig antibody, followed by developing with the 3,3′-diaminobenzidine substrate kit (Vector Laboratories). The nuclei were counterstained with Gill’s hematoxylin before mounting the slides with VectaMount permanent mounting medium (Vector Laboratories). Images were acquired with the Olympus BX53 light microscope using a 20× objective. To quantify the severity of the virus-induced lung damage, H&E images from multiple mouse lungs were scored as “normal/0” (absence of abnormalities), “mildly affected/1” (< 25% affected area per field), “moderately affected/2” (25 to 50% affected area per field), and “severely affected/3” (>50% affected area per field) by examining four representative pathological abnormalities commonly observed in respiratory virus infection including inflammatory infiltrations, architectural damage in the respiratory tract, proteinaceous exudates, and alveolar hemorrhage. Rating of each pathological signs of the same image was summed to generate a final score ranging from 0 (normal) to 12 (most severe) points.
Study approval
Human lung tissues for ex vivo studies were retrieved from patients who underwent surgical operations at the Queen Mary Hospital, Hong Kong. All donors gave written consent as approved by the Institutional Review Board of HKU/Hospital Authority Hong Kong West Cluster. The use of animals was approved by the Committee on the Use of Live Animals in Teaching and Research of HKU.
Statistiques
Data on figures represented means and SDs. Statistical details of experiments can be found in the figure legends. Statistical comparison between different groups was performed by one-way analysis of variance (ANOVA), two-way ANOVA, Student’s t test, or log-rank (Mantel-Cox) test using GraphPad Prism 6. Differences were considered statistically significant when P Acknowledgments: We thank Ivy Hau-Yee Chan, Department of Surgery, HKU for facilitating the study. Funding : This work was partly supported by the donations of Michael Seak-Kan Tong, the Shaw Foundation Hong Kong, Richard Yu and Carol Yu, May Tam Mak Mei Yin, Respiratory Viral Research Foundation Limited, Lee Wan Keung Charity Foundation Limited, Hong Kong Sanatorium & Hospital, Hui Ming, Hui Hoy and Chow Sin Lan Charity Fund Limited, the Chan Yin Chuen Memorial Charitable Foundation, Marina Man-Wai Lee, the Hong Kong Hainan Commercial Association South China Microbiology Research Fund, the Jessie & George Ho Charitable Foundation, Perfect Shape Medical Limited, Kai Chong Tong, Tse Kam Ming Laurence, Foo Oi Foundation Limited, Betty Hing-Chu Lee, Ping Cham So, and the Lo Ying Shek Chi Wai Foundation. This work was also partly supported by funding from the Hong Kong Health and Medical Research Fund (16150572 and CID-HKU1-5) of the Food and Health Bureau, Hong Kong Special Administrative Region Government; the General Research Fund (17124415 and 17124220) of Research Grants Council, Hong Kong Special Administrative Region Government; Innovation and Technology Fund (ITF), the Government of the Hong Kong Special Administrative Region; the Consultancy Service for Enhancing Laboratory Surveillance of Emerging Infectious Diseases and Research Capability on Antimicrobial Resistance for Department of Health of the Hong Kong Special Administrative Region Government; the National Program on Key Research Project of China (grant no. 2020YFA0707500 and 2020YFA0707504); the HKU Seed Fund (201711159220 and 201811159126); Sanming Project of Medicine in Shenzhen, China (SZSM201911014); and the High Level-Hospital Program, Health Commission of Guangdong Province, China. Author contributions: Conceived and designed the experiments: H.C. H.S. J.F.-W.C. and K.-Y.Y. Performed experiments: H.C. H.S. Y.H. X. Zhang, L.W. X.H. B.H. D.Y. Y.W. C.Y. B.H.-Y.W. C.L. X. Zhao, V.K.-M.P. J.-P.C. and S.Y. Data analysis: H.C. H.S. K.K.-Y.W. M.-L.Y. J.Z. R.K.-H.A.-Y. D.-Y.J. K.-H.K. S.P. J.F.-W.C. and K.-Y.Y. Wrote the manuscript: H.C. H.S. S.P. J.F.-W.C. and K.-Y.Y. Competing interests: J.F.-W.C. has received travel grants from Pfizer Corporation Hong Kong and Astellas Pharma Hong Kong Corporation Limited and was an invited speaker for Gilead Sciences Hong Kong Limited and Luminex Corporation. The other authors declared no other competing interests. The funding sources had no role in study design, data collection, analysis or interpretation, or writing of the report. Data and materials availability : All data needed to evaluate the conclusions in the paper are present in the paper and/or the Supplementary Materials. Additional data related to this paper may be requested from the authors.
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