La pandémie de COVID-19 a révélé la vulnérabilité prononcée des personnes âgées et des malades chroniques à la morbidité et à la mortalité induites par le SRAS-CoV-2. La sénescence cellulaire contribue à l'inflammation, à de multiples maladies chroniques et à un dysfonctionnement lié à l'âge, mais les effets sur les réponses à l'infection virale ne sont pas clairs. Ici, nous démontrons que les cellules sénescentes (SnC) deviennent hyper-inflammatoires en réponse aux modèles moléculaires associés aux agents pathogènes (PAMP), y compris SARS-CoV-2 Spike protein-1, augmentant l'expression des protéines d'entrée virale et réduisant l'expression des gènes anti-viraux chez les non-SnC par un mécanisme paracrine. De vieilles souris gravement infectées par des agents pathogènes qui comprenaient un β-coronavirus de souris lié au SRAS-CoV-2 ont connu une sénescence et une inflammation accrues avec une mortalité de près de 100 %. Le ciblage des SnC à l'aide de médicaments sénolytiques avant ou après l'exposition aux agents pathogènes a considérablement réduit la mortalité, la sénescence cellulaire et les marqueurs inflammatoires et augmenté les anticorps antiviraux. Ainsi, la réduction de la charge SnC chez les personnes malades ou âgées devrait améliorer la résilience et réduire la mortalité suite à une infection virale, y compris le SRAS-CoV-2.

La vieillesse est le plus grand facteur de risque par ordre de grandeur pour la plupart des maladies chroniques, y compris les cancers, le diabète, les maladies cardiovasculaires et la maladie d'Alzheimer. Le vieillissement prédispose également aux syndromes gériatriques et à la perte de résilience physique. La pandémie actuelle de COVID-19 a mis en lumière la vulnérabilité exquise des personnes âgées et des personnes atteintes de syndromes gériatriques sous-jacents à une mortalité accrue due au SRAS-CoV-2 (1-5). Ainsi, des approches visant à étendre la durée de vie et à améliorer la résilience physique pourraient réduire le taux de mortalité chez les patients âgés atteints de COVID-19.

La sénescence cellulaire est devenue l'un des mécanismes à l'origine du vieillissement et des maladies liées à l'âge qu'il est le plus facile de cibler thérapeutiquement (6, 7). La sénescence est un destin cellulaire provoqué en réponse à des signaux de stress cellulaires externes et internes, établis par des cascades de facteurs de transcription qui peuvent inclure la protéine p16INK4a/rétinoblastome et/ou p53/p21CIP1, qui provoquent des changements importants dans l'expression des gènes, des modifications des histones, la fonction des organites, production de protéines et de profonds changements morphologiques et métaboliques (8, 9). Une fraction significative des cellules sénescentes (SnC) libère des facteurs inflammatoires, des chimiokines, des facteurs de croissance, des protéases, des lipides bioactifs, des vésicules extracellulaires et des facteurs procoagulants, appelés phénotype sécrétoire associé à la sénescence ou SASP (6).

La sénescence est un mécanisme suppresseur de tumeur robuste, le SASP agissant comme un chimiotactique stimulant la clairance à médiation cellulaire immunitaire des cellules sénescentes et voisines. Cependant, avec l'âge et de nombreuses maladies chroniques, le SnC s'accumule dans la plupart des tissus, probablement en raison de l'élimination inefficace du SnC par le système immunitaire et de la résistance à la mort cellulaire. Cette accumulation entraîne une inflammation stérile chronique, qui à son tour entraîne une perte de résilience et une prédisposition à de nombreuses maladies (10). SnC peut interférer avec le système immunitaire et la capacité des cellules immunitaires à les éliminer. Par exemple, les facteurs SASP, IL-6, MCP-1 et CCL11, modifient la migration des cellules myéloïdes, IP10/CXCL10 épuise les sous-ensembles critiques de lymphocytes T et les métalloprotéinases matricielles clivent le ligand du FAS et d'autres régulateurs du système immunitaire (11). Le SASP peut entraîner une fibrose (11). Il a été démontré que le SnC joue un rôle causal dans le vieillissement et les maladies liées à l'âge dans des modèles précliniques. La transplantation de SnC dans de jeunes souris provoque un état de vieillissement accéléré, tandis que la destruction sélective génétique ou pharmacologique de SnC atténue la maladie, améliore la fonction physique et retarde la mortalité toutes causes confondues chez les souris plus âgées (12-14). Il est important de noter que les facteurs qui sont des composants communs du SASP sont liés à une maladie prolongée, une hyper-inflammation/une tempête de cytokines/un syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA), une myocardite avec fuite de troponine, des déficiences en lymphocytes T, une coagulation, un délire et une défaillance multiviscérale chez Patients atteints du SRAS-CoV2 (15). De plus, une signature des facteurs SASP IL-6, IL-10 et IP-10 chez les patients COVID-19 semble prédire la progression clinique (16). Cependant, on ne sait pas si les SnC et leur SASP pro-inflammatoire contribuent à l'augmentation de la mortalité observée chez les personnes âgées et les maladies chroniques après une infection.

Initialement, pour déterminer si les SnC ont une réponse altérée à l'exposition aux agents pathogènes par rapport aux cellules saines, nous avons traité les pré-adipocytes humains sénescents induits par l'irradiation et les cellules non sénescentes avec le lipopolysaccharide (LPS) du facteur de motif moléculaire associé aux agents pathogènes (PAMP). Le LPS a stimulé l'expression d'IL1α, IL1β, IL6, MCP1 et PAI2 chez les non-SnC (Fig. 1A, fig. S1 et tableau S1) mais n'a pas modifié de manière significative les niveaux de p16INKa ​​ou p21CIP1. L'expression de ces facteurs SASP, ainsi que l'IL10 et le PAI1 étaient tous significativement augmentés par le LPS dans le SnC par rapport au SnC non traité et par rapport au non-SnC traité au LPS, suggérant que les PAMP exacerbent le SASP et que le SnC peut amplifier la réponse inflammatoire aux PAMP. Pour déterminer si un effet similaire se produit in vivo, des souris de type sauvage (WT) jeunes et âgées ont été confrontées au LPS. Les marqueurs de sénescence et SASP ont été mesurés 24 heures après le traitement. Bien que l'expression des marqueurs de sénescence, p16Ink4a et p21Cip1, n'ait pas été affectée à ce stade précoce, l'exposition au LPS a stimulé une augmentation significative de l'expression de Il1α, Il1β, Il6, Il10, Mcp1, Tnfα, Pai1 et Pai2 dans le foie (Fig. 1B) et des reins (fig. S2) des souris âgées par rapport aux jeunes souris. De plus, la provocation par LPS a significativement augmenté les niveaux des facteurs SASP IL-6, MCP-1 et TNFα dans le sérum de souris âgées (Fig. 1C). Pour confirmer l'effet du LPS sur des souris âgées avec une charge SnC accrue, nous avons également traité des souris progéroïdes Ercc1-/∆ (fig. S3), qui expriment des niveaux élevés de sénescence et de marqueurs SASP dans les mêmes tissus et dans la même mesure que cela se produit. chez les souris de type sauvage bien que beaucoup plus tôt dans la vie (17), de manière aiguë avec le LPS. Les marqueurs de sénescence et SASP ont été mesurés 24 heures après le traitement. Bien que l'expression des marqueurs de sénescence p16Ink4a et p21Cip1 n'ait pas été affectée à ce stade précoce, le LPS a significativement augmenté l'expression des facteurs SASP (Il1α, Il1β, Il6, Tnfα et Mcp1) dans les reins et le foie des souris progéroïdes par rapport aux souris sauvages du même âge. -type contrôles (fig. S3) et augmentation significative des taux d'IL-6 et de MCP-1 circulants (fig. S3). Sur la base de ces résultats, nous avons émis l'hypothèse que les SnC exposés à des signaux associés aux agents pathogènes contribuent à l'hyper-inflammation et à la tempête de cytokines après une infection par des agents pathogènes.

Fig. 1 Le phénotype sécrétoire associé à la sénescence (SASP) est amplifié par des facteurs de motif moléculaire activé par un agent pathogène (PAMP).(UNE) Des progéniteurs adipocytaires humains isolés à partir de biopsies de graisse sous-cutanée ont été induits à subir une sénescence avec 10 Gy de rayonnement ionisant (SnC) ou non (non-SnC) (n = 5 sujets). Les cellules ont été traitées avec 10 ng du prototype PAMP, lipopolysaccharide (LPS) pendant 3 heures avant l'isolement de l'ARN. L'expression des gènes a été mesurée par qPCR et l'expression dans les cellules traitées au LPS a été normalisée par rapport aux échantillons traités par le véhicule. Moyens ± SEM. La signification statistique a été calculée à l'aide d'un modèle à effets mixtes pour l'effet du LPS sur le SnC et ses effets différentiels sur le SnC par rapport aux non-SnC. Le tableau supplémentaire S1 contient des détails. Flèches et astérisques : gris = SnC traité par véhicule vs non SnC ; noir = SnC traité au LPS vs non SnC ; rouge = SnC ± LPS. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. (B) Des souris jeunes (âgées de 2 mois) et âgées (âgées de 26 mois) ont été traitées avec du PBS (n = 5 ans et 5 o) ou du LPS (n = 4 ans et 3 o) et des tissus prélevés 24 heures plus tard. L'ARN a été isolé du foie et l'expression des gènes mesurée par qPCR. L'expression chez les souris traitées au LPS a été normalisée par rapport aux animaux traités avec le véhicule. Moyennes ± SEM, ANOVA bidirectionnelle et comparaison post-hoc La différence honnêtement significative de Tukey utilisée pour comparer les deux cohortes d'animaux au sein d'un groupe de traitement. Flèches et astérisques : gris = vieux vs jeunes traités avec le véhicule ; noir = vieux par rapport aux jeunes traités au LPS ; rouge = ancien ± LPS. **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Les données rénales de la fig. S2. (C) Protéine sérique des mêmes souris mesurée par ELISA. Les statistiques décrites dans B.

Les cellules sénescentes ont une réponse altérée à la protéine de pointe du SRAS-CoV-2

L'entrée virale par les récepteurs de la surface cellulaire et l'atténuation de l'expression des gènes antiviraux de l'hôte sont des étapes critiques dans la réussite des infections et de la propagation du virus (18). La glycoprotéine de pointe 1 (S1) du SRAS-CoV-2, contre laquelle des anticorps sont actuellement testés dans des essais cliniques (NCT04425629), médie l'entrée dans les cellules hôtes en se liant à l'enzyme de conversion de l'angiotensine 2 (ACE-2), entraînant une augmentation Signalisation NF-κB et production de cytokines inflammatoires (19, 20). Les cellules endothéliales peuvent être infectées directement par le SRAS-CoV-2, entraînant une amplification de l'inflammation avec des changements importants dans la morphologie endothéliale et une perturbation des jonctions intercellulaires (21).

Pour traiter spécifiquement de l'impact des PAMP du SRAS-CoV-2 sur le SnC, des cellules endothéliales de rein humain sénescent (fig. S4) ont été traitées avec la protéine S1 recombinante apyrogène. L'exposition de SnC endothéliale à S1 pendant 24 heures a significativement augmenté la sécrétion de la majorité des facteurs SASP endothéliaux mesurés dans les milieux conditionnés (score composite p < 0,0089 comparant SnC à non-SnC : Fig. 2A et tableau S2). Des résultats similaires, quoique moins spectaculaires, ont été obtenus en utilisant des cellules endothéliales rénales dans lesquelles la sénescence était induite par réplication plutôt que par rayonnement (fig. S5 et tableau S3). De plus, le traitement des progéniteurs adipocytaires sous-cutanés humains SnC avec S1 a augmenté l'expression des principaux facteurs SASP pré-adipocytaires, IL1α et IL1β, au niveau de l'ARNm (fig. S6). Conformément aux données du LPS, ces données suggèrent que S1 est un PAMP qui peut déclencher un état hyper-inflammatoire dans le SnC, éventuellement par stimulation d'un TLR (22, 23), le profil inflammatoire différant selon les types de SnC. Fig. 2 La protéine de pointe SARS-CoV2-1 (S1) exacerbe le phénotype sécrétoire des cellules endothéliales humaines sénescentes, diminuant les défenses virales et augmentant l'expression des gènes d'entrée/de traitement viral.(UNE) Des cellules endothéliales primaires de rein humain (n = 9 réplicats biologiques) ont été induites à subir une sénescence avec 10 Gy de rayonnement ionisant (SnC) ou non (non SnC) puis traitées avec 500 ng de véhicule recombinant S1 ou PBS pendant 24 heures. Trente protéines liées au SASP ont été mesurées dans les milieux conditionnés (CM) par la technologie Luminex xMAP. L'abondance relative induite par S1, normalisée aux cellules non sénescentes traitées avec le véhicule (non-SnC + Veh), est illustrée dans la carte thermique. Un modèle à effets mixtes a été utilisé pour tester l'effet de S1, la sénescence et leur interaction, en prenant en compte les mesures en double au sein d'un sujet pour chaque protéine ainsi que le score composite. Les effets de marge du SnC dans le groupe de traitement ont également été testés dans le cadre du modèle à effets mixtes. Dans l'ensemble, l'effet de S1 sur SnC était significativement plus prononcé que sur les non-SnC (changement de score composite p < 0,0089 ; les valeurs moyennes et les valeurs p pour chaque cytokine sont dans le tableau supplémentaire S2). (B) Schéma d'expériences en C, E et F. Des cellules humaines primaires ont été induites à subir une sénescence avec 10 Gy de rayonnement ionisant (SnC) ou non (non-SnC). Vingt jours plus tard, le CM a été collecté (n = 4 réplicats biologiques) et utilisé pour traiter les non-SnC (n = 4 réplicats biologiques) avec ou sans anticorps anti-IL-1α, IL-18 et PAI-1 (seul ou en combinaison) pendant 48 heures, puis ARN isolé pour mesurer l'expression des gènes liés à la pathogenèse du SRAS-CoV-2 par qPCR. L'expression dans les cellules traitées avec SnC CM a été normalisée par rapport aux cellules traitées avec non SnC CM. Données affichées en moyenne ± SEM, modèle à effets mixtes. *p < 0,05 **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. (C). Expression d'IFITM dans des cellules endothéliales de rein humain traitées avec du CM de SnC par rapport à des cellules endothéliales de rein humain non SnC. (ré) Expression d'IFITM dans des cellules endothéliales rénales humaines exposées à deux concentrations d'IL-1α (n = 4 réplicats biologiques). L'expression a été normalisée par rapport aux échantillons traités avec le véhicule. (E) Expression génique dans des cellules épithéliales pulmonaires humaines traitées avec CM de SnC par rapport à des pré-adipocytes non SnC, des HUVEC ou des cellules endothéliales rénales. (F) Expression de TMPRSS2 dans des cellules endothéliales rénales humaines traitées avec du CM de SnC vs des cellules endothéliales rénales non SnC avec ou sans anticorps neutralisants ou des cellules endothéliales rénales humaines avec de l'IL-1α recombinante pendant 48 heures. (g) Des biopsies pulmonaires humaines acquises pour des indications cliniques de causes focales non infectieuses chez des patients âgés ont été colorées pour TMPRSS2, p16INK4a et DAPI pour détecter les noyaux (n = 5 sujets). Des images représentatives sont affichées. Barre d'échelle = 20 m. (H) TMPRSS2+, p16INK4a+ et les noyaux totaux ont été comptés et exprimés en fonction des noyaux totaux dans chaque champ. Les cellules/champ TMPRSS2+ et p16INK4a+ étaient étroitement liés (p < 0,0001 ; corrélation partielle de Pearson). Chaque série de points de couleur représente des répliques d'un seul sujet. Les facteurs inflammatoires SASP contribuent à éliminer les agents pathogènes. Cependant, certains facteurs inflammatoires/SASP libérés par les types de cellules pulmonaires humaines sénescentes, notamment IL-1α, IL-1β, IL-6, MCP-1, TNFα et MMP-1, sont au cœur de la tempête pathologique de cytokines observée dans certains COVID-. 19 patients (4, 5, 24-33). Initialement, pour déterminer si le SASP a un impact sur la réponse des cellules endothéliales humaines à l'exposition aux agents pathogènes, des cellules endothéliales rénales primaires non sénescentes ont été exposées à des milieux conditionnés (CM) de SnC ou non SnC (Fig. 2B). Le CM des cellules endothéliales SnC a considérablement réduit l'expression des principaux gènes de défense virale IFITM2 et IFITM3 (Fig. 2C). L'IL-1α est un pyrogène naturel ainsi qu'un régulateur principal en amont du réseau de cytokines IL-6/IL-8 associé à la sénescence (34). Elle est élevée chez les patients COVID-19 (35), augmentée chez les SnC traités avec S1 (fig. S6) et augmentée chez les souris traitées au LPS (Fig. 1B et fig. S2 et S3). Le traitement direct des cellules endothéliales humaines primaires non sénescentes avec l'IL-1α a réduit de manière significative l'expression d'IFITM2 et d'IFITM3 (Fig. 2D). La suppression des facteurs SASP IL-18, PAI-1 et IL-1α, en prétraitant le CM de SnC avec des anticorps neutralisants contre ces protéines a partiellement restauré l'expression d'IFITM2 et IFITM3 (Fig. 2C). Ces données appuient la conclusion que le SASP du SnC préexistant pourrait exacerber l'infection par le SRAS-CoV-2 des cellules endothéliales humaines non sénescentes. Ensuite, nous avons examiné l'impact du SASP sur les cellules épithéliales pulmonaires humaines, un autre type de cellule cible dans COVID-19. Le traitement des cellules épithéliales pulmonaires humaines primaires non sénescentes avec des CM provenant de préadipocytes humains sénescents, de cellules endothéliales rénales ou de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) a considérablement augmenté l'expression des gènes d'entrée virale du SRAS-CoV-2 ACE2 et TMPRSS2 (Fig. 2E). De même, le traitement de cellules endothéliales primaires de rein humain non sénescent avec CM de SnC a induit l'expression de TMPRSS2 (Fig. 2E). L'ajout d'anticorps neutralisants contre l'IL-1α au CM à partir de cellules endothéliales rénales SnC a réduit l'expression de TMPRSS2 contrairement à l'anti-IL-18 (Fig. 2F). Le traitement des cellules endothéliales primaires humaines non sénescentes directement avec l'IL-1α a multiplié par cinq l'expression de TMPRSS2 (Fig. 2F) et le traitement par l'IL-1 des cellules épithéliales pulmonaires humaines non sénescentes a multiplié par 2 l'expression de l'ACE2 et de TMPRSS2 (fig. S7A ). Le traitement des cellules endothéliales rénales humaines non sénescentes avec IL-1α a également augmenté de manière significative l'expression d'IL6, IL8, IP10 et MCP1 (fig. S7B). De plus, bien que ACE2 et TMPRSS2 n'aient pas été régulés à la hausse dans les pré-adipocytes humains sénescents (fig. S7C) dans lesquels ces gènes ne sont pas normalement exprimés, TMPRSS2 a été régulé à la hausse dans les cellules endothéliales humaines sénescentes (fig. S7D). Conformément à ces résultats in vitro, dans le tissu pulmonaire humain sain réséqué de cinq patients âgés pour des indications cliniques de causes focales non infectieuses, il y avait plus de cellules TMPRSS2+ adjacentes aux cellules p16INK4a+ détectées par immunofluorescence, avec l'abondance de cellules p16INK4a+ en corrélation avec Abondance des cellules TMPRSS2+ (Fig. 2, G et H). Collectivement, ces données appuient davantage la conclusion que le SnC pourrait favoriser la pathogenèse du SRAS-CoV-2 en diminuant les défenses virales et en augmentant l'expression des protéines d'entrée virale dans les non-SnC voisins grâce à une sécrétion amplifiée de facteurs SASP.

Les vieilles souris sont hypersensibles à l'exposition aux agents pathogènes, y compris l'infection à -coronavirus

Pour étudier le rôle de la SnC dans les effets indésirables de l'infection in vivo, nous avons exploité un paradigme expérimental développé pour étudier la réponse des souris de laboratoire (sans agent pathogène spécifié ; SPF) à l'infection par des microbes murins communs, créant ce qu'on appelle un expérience microbienne » (NME) (36-38). Les souris expérimentales sont exposées à des agents pathogènes par cohabitation avec des souris d'animalerie ou par exposition à leur litière sale. L'exposition aux NME pendant plusieurs mois compromet rarement la viabilité des jeunes souris. En revanche, l'exposition de souris âgées (âgées de plus de 20 mois) au même NME a rapidement provoqué une létalité de près de 100 % en moins de 2 semaines et chez les deux sexes (Fig. 3A et Fig. S8A). Chez les souris euthanasiées les jours 6 et 7 après l'exposition au NME, l'expression des marqueurs de sénescence (p21Cip1 et p16Ink4a) et des facteurs SASP (Il6, Mcp1 et Tnfα) dans le foie, les reins et, dans une moindre mesure, dans les poumons était augmentée dans les anciens NME. souris par rapport aux souris SPF âgées, jeunes SPF ou jeunes NME (Fig. 3B). De plus, il y avait une augmentation de l'infiltration des cellules CD45+ dans le foie au jour 6-7 après l'exposition au NME chez les souris jeunes et âgées (fig. S8B). Il est important de noter que le pourcentage de cellules immunitaires infiltrées était significativement plus élevé chez les souris âgées que chez les jeunes animaux. Ces résultats sont cohérents avec la propagation de la sénescence et de l'inflammation suite à l'exposition aux agents pathogènes. De plus, il y a eu une augmentation significative des cytokines inflammatoires liées au SASP (IL-6, IL-10, EOTAXIN/CCL11 et TNFα) dans le sérum de vieilles souris NME par rapport aux jeunes souris NME (Fig. 3C), ce qui correspond à SnC préexistant créant un environnement qui contribue à l'hyperinflammation lors de l'infection.

Fig. 3 Les souris âgées sont vulnérables à une expérience microbienne normale (NME) qui comprend une infection aiguë par le -coronavirus de la souris.(UNE) Des souris WT jeunes (3 mois) et âgées (20-24 mois) ont été exposées à de la litière NME produite à partir de souris d'animalerie pendant 7 jours. La survie a été surveillée pendant 35 jours après le début de l'EMN (n = 10 jeunes ; n = 18 ans). Test du log-rank (Mantel Cox). (B) Expression génique dans trois tissus de souris jeunes et âgées SPF ou NME (exposition de 6 à 7 jours) (n = 3 jeunes SPF ; n = 5 vieux SPF ; n = 14 jeunes NME ; n = 13 vieux NME) mesurée par qPCR. L'expression a été normalisée à de jeunes souris SPF. Moyennes ± SEM, ANOVA bidirectionnelle et comparaison post-hoc La différence honnêtement significative de Tukey utilisée pour comparer les deux cohortes d'animaux au sein d'un groupe de traitement. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Flèches et astérisques : gris = SPF vieux versus jeune ; noir = NME vieux versus jeune ; rouge = ancien SPF par rapport à l'ancien NME. (C) Taux de cytokines sériques chez les souris jeunes et âgées (n = 3 jeunes SPF ; n = 5 vieux SPF ; n = 19 jeunes NME ; n = 17 vieux NME) mesurés par ELISA au jour 5 post-NME. Statistiques telles que décrites en B. (ré) Sérologie pour détecter les anticorps contre les microbes dans la litière NME. À droite se trouvent les agents pathogènes murins couramment testés par le Charles River Laboratory pour définir le logement SPF. Les diagrammes circulaires illustrent les expositions détectées chez des souris individuelles jeunes et âgées (n = 24 jeunes; n = 21-23 ans) le jour 11 après le début de l'EMN. La sérologie des souris d'animalerie est illustrée ci-dessous. (E) Images représentatives de la coloration H&E ou de l'immunohistochimie MHV dans des coupes de foie de souris jeunes et âgées exposées à la NME. (F) (Haut) Schéma pour illustrer la conception expérimentale. Des souris femelles jeunes (6 mois) ou âgées (22 mois) ont été inoculées avec une dose sublétale de MHV. Trente jours plus tard, des souris naïves et inoculées ont été exposées à de la litière NME pendant 3 semaines. (En bas) Anticorps sériques contre 3 antigènes MHV différents mesurés 21 jours après l'inoculation du MHV et rapportés sous forme de scores relatifs. La ligne pointillée représente la limite de détection (LOD). Moyennes ± SEM, test t de Student bilatéral non apparié. **p < 0,01, ****p < 0,0001. (g) Survie de souris inoculées au MHV et de souris naïves mesurées pendant 42 jours après le début de la NME. Log-rank test. Plusieurs virus ont été détectés dans la salive et les boulettes fécales des souris NME une semaine après l'exposition à des souris d'animalerie, dont le virus de l'hépatite mouse-coronavirus (MHV), un virus de la même famille que le SRAS-CoV-1&2 (tableau S4). Cependant, au jour 11, lorsque la majorité des souris âgées avaient succombé à l'infection, les souris NME étaient sérologiquement positives pour le MHV, mais pas les autres agents pathogènes transportés par les souris des animaleries (Fig. 3D). L'histopathologie a indiqué que les souris âgées, mais pas les souris jeunes, présentaient des signes d'infection active par le MHV se manifestant par une hépatite nécrosante multifocale et la présence de cellules syncytiales spécifiques du MHV dans les zones de nécrose (Fig. 3E). De plus, des cellules syncytiales induites par le MHV ont été observées parmi les cellules épithéliales dans l'intestin grêle et le gros intestin de souris âgées (fig. S8C). Ces résultats sont cohérents avec une infection active chez les animaux âgés, contrairement à une clairance rapide chez les jeunes animaux. Pour déterminer si l'infection par le MHV contribue à la mortalité induite par le NME chez les souris âgées, des souris jeunes et âgées ont été directement infectées avec une dose sublétale de MHV (souche A59) avant l'exposition au NME (Fig. 3F). Les vieilles souris provoquées par le MHV ont généré une réponse en anticorps réduite par rapport aux jeunes souris (Fig. 3F). Cependant, l'immunisation MHV a empêché la mort des vieilles souris après exposition au NME bien que les animaux aient été infectés par plusieurs autres virus (tableau S5), tandis que les vieilles souris naïves ont succombé (Fig. 3G). Cela fournit des preuves convaincantes que le -coronavirus MHV est le principal facteur de mortalité chez les souris âgées dans le paradigme NME.

Les sénolytiques réduisent la sénescence, l'inflammation et la mortalité suite à l'exposition aux agents pathogènes

Pour déterminer si les médicaments qui induisent spécifiquement l'apoptose de la SnC, appelés sénolytiques, réduisent la mortalité des vieilles souris gravement infectées par des agents pathogènes, nous avons testé la Fisetin, un flavonoïde naturel présent dans de nombreux fruits et légumes (39, 40) que nous avons établi comme sénolytique (14, 41). La fisétine améliore l'homéostasie tissulaire, inverse les lésions tissulaires liées à l'âge et prolonge la durée de vie médiane des souris, même lorsqu'elle est administrée tard dans la vie, sans effet indésirable observable (14, 41).

De vieilles souris ont été exposées au NME pendant 1 semaine à partir du jour 0 et ont ensuite été traitées avec 20 mg/kg de Fisetin par gavage oral les jours 3, 4 et 5 et 10, 11 et 12 après l'exposition à l'agent pathogène (Fig. 4A), sans preuve d'effets indésirables. Entre les doses de Fisetin, les souris recevaient une dose d'entretien de Fisetin (500 ppm de fisetine dans de la nourriture ad libitum). Conformément à nos résultats précédents (Fig. 3A), 100 % des souris âgées dans les groupes témoins du véhicule sont mortes dans les 2 semaines (Fig. 4B sexes combinés et S9A représenté graphiquement par sexe). Cependant, 64 % des souris mâles traitées à la Fisetin et 22 % des souris femelles ont survécu à long terme avec une prolongation significative de la durée de vie globale pour les deux sexes. L'existence d'une véritable différence entre les sexes dans l'effet de la Fisetin sur la survie doit être explorée plus avant, car les âges des vieilles souris mâles et femelles n'étaient pas identiques.

Fig. 4 Le traitement avec la fisétine sénolytique diminue la mortalité chez les souris âgées exposées aux NME.(UNE) Schéma de l'expérience. Des souris jeunes (6-7 mois) et âgées (20-24 mois) ont été exposées à une litière NME contenant du -coronavirus murin MHV pendant 7 jours. Les souris ont été traitées avec 20 mg/kg/jour de Fisetin ou un véhicule uniquement par gavage oral quotidiennement pendant 3 jours consécutifs à partir du jour 3 après le début de la NME. Les 3 jours de traitement ont été répétés (3 jours de suite, 4 jours de repos) pendant 3 semaines. Les animaux ont également reçu de la nourriture standard avec de la Fisetine ajoutée (500 ppm) ad libitum après le début du traitement. (B) La survie a été mesurée pendant 36 jours après le début de l'EMN (n = 9 jeunes + véhicule ; n = 5 jeunes + Fisetin ; n = 18 vieux + véhicule ; n = 19 vieux + Fisetin). Log-rank test. p < 0,0001 pour les souris âgées ± Fisétine. (C) Score relatif d'anticorps MHV chez les souris jeunes et âgées en B le jour indiqué après le début de la NME. (ré à g) Des souris jeunes (âgées de 2 mois) et âgées (âgées de 20 mois) ont été exposées à une litière NME ± traitement avec de la Fisetin comme décrit dans A. Aux jours 8-9 après le début de la NME, les animaux ont été euthanasiés et les tissus collectés pour mesurer l'expression des gènes (n = 10 jeunes + véhicule ; n = 8-10 jeunes + Fisetin ; n = 10-11 vieux + véhicule ; n = 13 vieux + Fisetin). Toutes les données d'expression ont été normalisées pour de jeunes souris traitées avec le véhicule. Données affichées sous forme de moyennes ± SEM, ANOVA bidirectionnelle et comparaison post-hoc La différence honnêtement significative de Tukey utilisée pour comparer les deux cohortes d'animaux au sein d'un groupe de traitement. Flèches et astérisques  : gris = vieux traités avec le véhicule par rapport aux jeunes ; noir = vieux par rapport aux jeunes traités à la Fisétine ; rouge = ancien ± Fisetin. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. (D) L'ARNm du MHV a été quantifié par qPCR dans des boulettes fécales recueillies auprès d'animaux individuels en C. (E) Quantification de l'ARNm de p16Ink4a et p21Cip1 dans quatre tissus. (F) Quantification de l'ARNm du facteur SASP dans le foie. Les données sur d'autres gènes et tissus de la fig. S9. (G) Taux de protéines SASP dans le foie mesurés par ELISA. Notamment, au jour 11 post-NME, les niveaux relatifs d'anticorps anti-MHV étaient considérablement plus bas chez les souris âgées que chez les jeunes souris (figure 4C), ce qui correspond à la mort prématurée des souris âgées. Cependant, chez les souris âgées traitées avec Fisetin, les anticorps contre le MHV ont été augmentés à des niveaux de jeunesse au jour 16. Toutes les souris exposées au NME ont été confirmées positives pour le MHV par RT-PCR 8 jours après l'exposition (Fig. 4D). Fait intéressant, les souris âgées avaient significativement plus d'ARNm viral que les jeunes souris (Fig. 4D), ce qui correspond à des réponses immunitaires altérées chez les organismes âgés (Fig. 3F) et à des défenses virales altérées dues aux cellules sénescentes (Fig. 2C). Cependant, une courte durée de traitement par Fisetin initié 3 jours après l'exposition au NME a eu tendance à réduire la charge d'ARNm viral chez les souris âgées (Fig. 4D; p = 0,09). Pour évaluer comment Fisetin médie ses effets protecteurs sur la mortalité induite par le NME chez les souris âgées, nous avons mesuré la sénescence et les marqueurs SASP avant la mort. Les marqueurs SnC (p16Ink4a ou p21Cip1) ont été réduits dans le foie, les reins, les poumons et la rate des vieilles souris NME traitées par Fisetin par rapport aux vieilles souris recevant uniquement le véhicule (Fig. 4E). De plus, l'expression de plusieurs facteurs inflammatoires SASP, y compris Ifnγ, Il1α, Il1β, Il6, Il17, Tnfα, Cxcl1, Cxcl2, Cxcl10, Mcp1, Mip1, Pai1, Pai2, Il2 et Il7 a été réduite à des degrés divers dans les mêmes tissus ( fig. 4F et fig. S9B). De même, les niveaux d'IL-1β, d'IL-6, de MCP-1 et de TNFα circulants ont été réduits après le traitement par Fisetin (Fig. 4G). Ainsi, bien que les vieilles souris aient été infectées par le MHV, la Fisetin a réduit la sénescence, le SASP et l'inflammation post-infection et a prolongé la survie, permettant une meilleure réponse des anticorps au virus.

La sénolyse contribue à l'amélioration des résultats chez les souris âgées exposées à des agents pathogènes

Pour déterminer si le mécanisme d'action de la Fisetin dans la suppression des effets indésirables de l'infection virale comprend la sénolyse, deux approches ont été adoptées. Tout d'abord, des souris INK-ATTAC ont été étudiées dans des conditions NME pour permettre l'ablation génétique de SnC exprimant p16Ink4a (42). Les souris INK-ATTAC expriment une protéine de fusion caspase 8-FKBP, ATTAC (43), à partir du promoteur p16Ink4a. De vieilles souris INK-ATTAC (> 24 mois) ont été traitées avec AP20187 pour entraîner la dimérisation de la FKBP, l'activation de la caspase-8 et l'apoptose des cellules exprimant p16Ink4a (3 jours par semaine × 2 semaines), avant l'exposition à la NME, puis hebdomadaire post-NME (Fig. 5A). Les souris témoins et traitées avec AP20187 étaient positives pour l'ARN du MHV au jour 8 après l'exposition au NME (Fig. 5B). Le traitement AP20187 a réduit l'expression des marqueurs SnC, p16Ink4a et p21Cip-1, et l'expression de l'eGFP, qui est également induite par le promoteur p16Ink4a chez les souris INK-ATTAC après exposition au NME (Fig. 5C), ainsi que certains gènes inflammatoires/SASP dans les reins, le foie, le cerveau, le pancréas et/ou le côlon (fig. S10). Le traitement par AP20187 a significativement retardé la mortalité induite par le NME chez les souris âgées mâles et femelles (Fig. 5D et Fig. S10A), fournissant des preuves que la sénolyse améliore les résultats chez les organismes âgés fortement exposés aux agents pathogènes. Le niveau d'ARN du MHV a également eu tendance à baisser après le traitement par AP20187 (Fig. 5B), ce qui est cohérent avec les résultats du traitement par Fisetin.

Fig. 5 L'ablation pharmacologique et génétique de la SnC réduit la mortalité chez les souris âgées exposées à la NME.(UNE) Diagramme schématique de la conception expérimentale pour B-D. Des souris INK-ATTAC mâles et femelles jeunes (4 mois) et âgées (22-30 mois) ont été traitées avec le véhicule ou AP20187 (n = 10 jeunes ; n = 19 vieux + véhicule ; n = 19 vieux + AP20187) pour dimériser la protéine de fusion FKBP-caspase-8 exprimée dans les cellules p16Ink4a+ pour tuer sélectivement SnC. AP20187 (10 mg/kg) ou le véhicule a été administré i.p. tous les jours pendant 3 jours à partir de 2 semaines avant le début de la NME et se terminant 1 semaine après (3 jours et 4 jours). NME a commencé le jour 0 et a duré une semaine. Des souris logées dans des conditions SPF ont été utilisées comme témoins. Les tissus ont été prélevés 7 jours après l'initiation de l'EMN dans une autre cohorte d'animaux mâles pour analyse moléculaire (n = 5 jeunes ; n = 3-4 vieux + véhicule ; n = 4 vieux + AP20187). (B) Quantification de l'ARNm du MHV dans des boulettes fécales isolées de souris individuelles. Moyenne ± SEM, ANOVA à sens unique avec le test de Tukey. **p < 0,01. (C) Quantification de l'eGFP (un rapporteur de l'expression de p16Ink4a dans la construction INK-ATTAC), de l'ARNm de p16Ink4a et de p21Cip1 dans le rein de souris en B. Toutes les données d'expression ont été normalisées pour de jeunes souris traitées avec le véhicule. Moyenne ± SEM, ANOVA à un facteur. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. (ré) Survie des souris mâles et femelles mesurée pendant 30 jours après le début de la NME. Log-rank test. (E) Des souris femelles jeunes (âgées de 2 mois, n = 5) et âgées (âgées de 22 mois, n = 10/groupe) ont été exposées à de la litière NME pendant 4 jours. À partir du jour 3, les souris ont été traitées avec 20 mg/kg de fisétine ou 5 mg/kg de dasatinib plus 50 mg/kg de quercétine aux jours 3, 4, 11 et 12 par gavage oral, ou avec un véhicule uniquement. La survie a été mesurée pendant 30 jours après le début de l'EMN. Log-rank test. (F) Courbes de survie pour des souris femelles WT de 20 mois (n = 10/groupe de traitement) traitées avec 20 mg/kg de Fisetin ou un véhicule par gavage oral les jours 3 et 4 après le début de l'exposition au NME. Log-rank test. (g) Survie de souris femelles WT de 22 mois (n = 9/groupe de traitement) traitées avec 20 mg/kg de Fisétine ou un véhicule uniquement par gavage oral aux jours 3, 4, 10 et 11 après l'exposition à la NME, surveillée jusqu'à 60 jours après. Log-rank test. Deuxièmement, nous avons testé un cocktail sénolytique différent bien établi, Dasatinib plus Quercetin (D+Q) (12, 13), et l'avons directement comparé à Fisetin dans la même expérience de survie. D+Q ou Fisetin a été administré à des souris femelles âgées aux jours 3 et 4 et 11 et 12 après le début de la NME (Fig. 5E). Comme prévu, alors que 100 % des vieilles souris traitées avec le véhicule ont succombé à l'infection, environ 50 % des vieilles souris traitées avec D+Q ou Fisetin ont survécu (figure 5E). La similitude des courbes de survie entre les deux groupes de traitement est remarquable. This combination of genetic and pharmacologic studies provides strong support for the conclusion that clearing SnC in old organisms contributes to improved outcomes upon acute exposure to viral pathogens. Finally, to determine if pretreating old mice with Fisetin prior to infection could prevent adverse outcomes, old WT mice were treated with a single round of high dose Fisetin (20 mg/kg/day for two consecutive days beginning three days prior to NME exposure), followed by low dose Fisetin following infection (fig. S11A). This suppressed mortality in both male and female mice by 40% (fig. S11, A and B). Additionally, anti-MHV antibodies were detected in Fisetin-treated mice on days 16 and 21 (fig. S11C), a time by which all vehicle-treated old mice had died (fig. S11A). To evaluate whether a shorter regimen of senolytic therapy could improve outcomes in old NME mice, animals were given two doses of Fisetin after NME exposure once (days 3 and 4; Fig. 5F) or twice (days 3,4 and 10,11; Fig. 5G). These short course treatments, in the absence of continuous exposure to Fisetin via chow, were sufficient to delay mortality significantly (Fig. 5, F and G). Since Fisetin has an elimination half-life of less than 5 hours (44), these data are consistent with a “hit and run” mechanism, whereby Fisetin is acting as a senolytic, reducing overall SnC burden, rather than being required to be present constantly to engage with a molecular target to confer benefit. The data also reveal that Fisetin can be administered in a pulsatile fashion before or after viral infection to reduce mortality of old organisms.

Discussion

Our study demonstrates that SnC are primed to respond to PAMPs by expressing and secreting even higher levels of inflammatory SASP factors. These PAMPs include the SARS-CoV-2 spike protein-1, which exacerbates the SASP of human SnC and, in turn, reduces innate viral defenses and increases expression of SARS-CoV-2 viral entry proteins in non-senescent human lung cells and tissue. Based on these observations, we formulated the “Amplifier/Rheostat” Hypothesis, whereby PAMPs, such as SARS-CoV-2 S1 viral antigen, cause a shift in the SASP of pre-existing SnC into a more highly inflammatory, pro-fibrotic SASP (Fig. 6). The amplified SASP factors include cytokines and chemokines, such as IL-1α, that exacerbate systemic inflammation and drive secondary senescence. These secondary SnC can then : 1) further exacerbate and prolong inflammation; 2) reduce viral defenses in non-SnC; 3) facilitate viral entry in non-SnC; 4) attenuate or delay recovery; 5) contribute to persistent frailty; 6) cause tissue fibrosis; and 7) contribute to hyper-inflammation and multi-organ failure.

Fig. 6 SASP Amplifier/Rheostat Hypothesis.Schematic of the hypothesis generated from these data and tested herein. SnC amplified the response to PAMPs in vitro and in vivo, resulting in increased production of pro-inflammatory cytokines and chemokines. This could exacerbate acute systemic inflammatory responses and cytokine release by innate immune cells and amplify the spread of senescence. This model could explain the increased risk of cytokine storm during COVID-19 or other infections and adverse outcomes observed in the elderly or those with chronic conditions associated with an increased burden of SnC (obesity, diabetes, chronic lung or kidney disease, cardiovascular disease).

Our Amplifier/Rheostat hypothesis is supported by in vivo results, first by using acute LPS treatment and subsequently by exposing old mice to a normal microbial environment (NME), which includes a mouse β-coronavirus related to SARS-CoV-2. We demonstrate that the SnC burden in old mice confers, at least in part, the reduced resilience, increased inflammation, impaired immune response, and mortality observed in old male and female mice exposed to new viral pathogens. Both the pharmacological (e.g. senolytics Fisetin or D+Q) and genetic (INK-ATTAC) clearance of SnC yielded significant delay, or in the case of the former reduction in mortality in both old male and female mice. Adverse outcomes were attenuated when the senolytic, Fisetin, was administered either prior to (a preventative measure) or after (a therapeutic intervention) NME exposure. The senolytics Fisetin and D+Q were more effective at delaying mortality than genetic ablation of SnC in the INK-ATTAC mice (Fig. 5F versus 5D), consistent with the fact that the latter only removes SnC expressing high levels of p16Ink4a, not p16-low or -negative SnC. However, subtle differences in fomite bedding make it difficult to compare lifespan data between experiments.

Although the NME paradigm does not directly model SARS-CoV-2 infection, NME exposure involves transmission of multiple common community-acquired mouse infectious agents. Among these is the β-coronavirus MHV, which is an enteric virus transmitted by oral/fecal spread rather than respiratory droplets. Even though MHV infects hepatocytes to a greater extent than pulmonary tissue, we did find evidence of inflammation in the lung, spleen, liver, gastrointestinal tract, and kidney, similar to COVID-19 patients. MHV was a primary viral pathogen transferred by the NME as evidenced by serology, qRT-PCR, and liver histopathology, and caused severe disease in aged, but not young, mice. Furthermore, MHV immunization conferred protection from NME-induced mortality, indicating an essential role for the β-coronavirus in the mortality of old mice. The NME model does accurately reflect the dramatic response of naïve organisms to a novel β-coronavirus, the age disparity in outcomes observed in COVID-19 patients, the hyperinflammation elicited in some hosts, and the common experience of opportunistic infections contributing to disease severity and mortality.

SnC burden is increased in old and young mice exposed to NME (Fig. 3B) and, if it persists, could lead to additional co-morbidities. However, the magnitude of senescence in young animals appears not to reach a threshold that compromises survival. Thus. Moreover, it is notable that it was not necessary to reduce senescence markers to the level of young individuals to dramatically improve survival. This supports the possibility that there is a threshold beyond which senescent cell burden is deleterious (13, 45) and illustrates that, unlike for cancer cells, not every SnC needs to be eliminated to have a beneficial effect.

A high SnC burden in the elderly or those with chronic diseases such as diabetes, obesity, hypertension, or chronic lung disease likely can interfere with the ability of the immune system to induce a strong B and T cell response to novel antigens. We found that intermittent senolytic treatment improved the development of an anti-MHV antibody response. This could be because the old mice survive long enough to mount a healthy response analogous to younger mice, or because dampening the SASP/inflammation improved immune cell function, or both. However, our preclinical data suggest that senolytics could improve the response of the elderly to vaccines for SARS-CoV-2 and others.

The immediate implication of these studies is that senolytics could have clinical application for attenuating mortality and other adverse outcomes in the elderly and those with comorbidities who become infected with SARS-CoV-2. Furthermore, based upon our findings in LPS-treated SnCs and aged mice, senolytics may be of potential therapeutic use for elderly persons stricken by bacterial infections. In addition, our data support the view that targeting pillars of aging and, in particular, cellular senescence, can improve resilience of the elderly in the face of viral pathogens. This strongly supports the Geroscience Hypothesis that targeting fundamental aging mechanisms can improve health span in the elderly and implies that targeting other pillars of aging might also alleviate morbidity due to viral infection. Thus, for the COVID-19 pandemic as well as future pandemics, rapalogs, glucocorticoids, and metformin, all of which inhibit the SASP, might lessen SARS-CoV-2 cytokine storm and improve outcomes (46–48). However, unlike senolytics, some of these drugs may need to be administered continuously or at least more frequently, adding to off-target and side effects, especially in elderly patients with co-morbidities and polypharmacy. Importantly, the SASP Amplifier Hypothesis, supported by data presented here, led to the initiation of a clinical trial (NCT04476953) to test whether Fisetin prevents disease progression in hospitalized older COVID-19 patients. A similar, but larger multi-site trial to test Fisetin in elderly COVID-19 patients in nursing homes (NCT04537299) also has been initiated. Finally, it is important to note that although there are now vaccines for SARS-CoV-2 being distributed, it will take a long time for a significant percentage of the world’s population to be vaccinated. Even if the 95% effectiveness rate of the vaccines in healthy populations is borne out in elderly nursing home residents, still at least 1 out of 20 vaccinated elderly residents is anticipated to become infected by COVID-19 and will need treatment, potentially with senolytics and anti-virals.

Material and methods

Animals

Wild-type C57BL/6 (young = 2-7 months of age; old = 20 months of age or older) mice were bred at the University of Minnesota or Mayo Clinic, purchased from Charles River (Wilmington, MA), Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME), or received from the Aging Rodent Colony at the National Institute of Aging (Baltimore, MD). C57BL/6 :FVB mice and Ercc1−/∆ mice were bred in the Niedernhofer laboratory at the University of Minnesota as previously described (49). The generation and characterization of the INK-ATTAC transgenic mouse line has been described (42). J.L.K. T.T. J.M. van Deursen, and D.J. Baker (all Mayo Clinic) designed the INK-ATTAC strategy. Pet store mice were purchased from local pet stores in the Minneapolis-St. Paul, MN metropolitan area. All mice were housed in AALAC-approved animal facilities at the University of Minnesota (BSL-1/-2 for SPF mice and BSL-3 for exposure to a natural microbial experience) or Mayo Clinic. Mice were randomly assigned to control or experimental groups based on weight and appearance. Experimental procedures were approved by the University of Minnesota and Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committees and performed following the Office of Laboratory Animal Welfare guidelines and PHS Policy on Use of Laboratory Animals.

Mouse experiments

LPS challenge : WT mice were injected intraperitoneally with either LPS (500 ng/kg) or vehicle (PBS). Animals were euthanized 24 hours post-injection and tissues collected. Total RNA was isolated from kidney and liver for the analysis of senescence and SASP marker expression by quantitative PCR (qPCR) using the ∆∆Ct method, with Gapdh serving as a housekeeping control. Serum levels of IL-6, MCP-1, TNF⍺ were analyzed by ELISA.

Normal microbial experience (NME)

Immune-experienced mice were obtained from different vendors around Minneapolis, MN and were used as carriers of transmissible pathogens (hereafter called pet mice). Laboratory strains of mice were either directly cohoused with pet mice (37) or were housed on soiled bedding (totaling 150-300 cm3/cage) that were collected from cages of pet store mice after 1 week of housing (fomites).

Senolytic preparation and administration

Fisetin (Indofine Chemical) or Dasatinib (LC laboratories. Cat# D-337, Woburn, MA) and Quercetin (Sigma. cat#Q4951-10G, St. Louis, MO) were dissolved in vehicle (10% ethanol, 30% polyethylene glycol 60% phosal 50 pg). Mice were weighed and given Fisetin (20 mg/kg), D+Q (5mg/kg+50mg/kg respectively), or vehicle control alone as indicated. Fisetin (500 ppm) was compounded into mouse chow (standard mouse diet, Lab Diet 5053). AP20187 was purchased from Clontech (Mountain View, CA). Vehicle (10% ethanol, 30% polyethylene glycol 60% phosal 50 pg) or AP20187 dissolved in vehicle was injected IP (10 mg/kg).

Tissue harvest

For RNA extraction, tissues were snap-frozen in liquid nitrogen and kept frozen until nucleic acid isolation. For histopathology, tissues were fixed in formalin and paraffin embedded.

Serology and measurement of viral RNA

Serum was collected at the indicated times for antibody screening using EZ-spot followed by a multiplexed fluorometric immunoassay (Charles River). The screening panel includes: mouse hepatitis virus (MHV), Sendai virus, pneumonia virus of mice, minute virus of mice (MVM), mouse parvovirus type 1(MPV), mouse parvovirus type 2, mouse parvovirus-NS1, murine norovirus (MNV), Theiler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV), reovirus, rotavirus EDIM, lymphocytic choriomeningitis virus, ectromelia virus, mouse adenovirus 1 and 2, mouse cytomegalovirus, polyoma virus, Mycoplasma pulmonis, Enchephalitozoon cuniculi, cilia-associated respiratory bacillus, and Clostridium piliforme. Relative serology scores for MHV antigens (recombinant A59-strain nucleocapsid protein, purified A-59 viral lysate, and purified S-strain viral lysate) were calculated by Charles River using median fluorescence index. Active pathogen infection was measured by PCR Rodent Infectious Agent (PRIA) array methods (Charles River) in samples collected from oral swabs or fecal material. This panel screened for MHV, MNV, MPV, MVM, Rodentibacter heylii, and Helicobacter species.

Infection with MHV-A59

MHV-A59 virus was a kind gift of Dr. Stan Perlman (U of Iowa). Virus was propagated and tittered onto 17cl-1 cells. Doses of 6x105-1x106 PFU were delivered intra-nasally after briefly anesthetizing mice with Isofluorane.

Histology

Formalin-fixed samples were processed and embedded in paraffin before being sectioned (4 μm) and stained with hematoxylin and eosin. MHV immunohistochemistry was performed using anti-MHV-JHM ascitic fluid (50) (gift from Dr. S. Compton, Yale University) and bound antibody was detected using the Dako ARK Peroxidase kit (Animal Research Kit, Code K3954) for detecting mouse primary antibodies (Agilent Dako, Carpinteria, CA). All histologic sections were analyzed by two board-certified veterinary pathologists (TWC, MGO’S).

Serum cytokines and chemokines

Serum samples were analyzed by the Cytokine Reference Laboratory (CRL, University of Minnesota). Samples were analyzed for mouse specific IP10, IL-6, IL-1β, KC, IL-2, IFNγ, TNFα, LIX, MCP-1 MIP2, MIP1α, GMCSF, IL-10, and eotaxin using the multi-plex Luminex platform. Magnetic bead sets (cat. # MPTMAG-70K-14) were purchased from EMD Millipore (Burlington, MA). Proteins were measured according to the manufacturer’s instructions. The beads were read on a Luminex instrument (Bioplex 200). Samples were run in duplicate and values were interpolated from 5-parameter-fitted standard curves. Serum concentrations of IL-6 (Abcam cat.# ab222503) and MCP-1 (Raybiotech cat.# ELM-MCP1-CL1, Peachtree Corners, GA) in LPS- and vehicle-treated mice (Fig. 1 and figs. S2 and S3) were measured by single-analyte ELISAs with a Varioskan plate reader. Samples were run in duplicate.

Measurement of cytokines and chemokines in liver

100 mg of tissue was homogenized in RIPA buffer and Complete Mini EDTA-free Protease Inhibitor and adjusted to 1 mg/mL. Samples were analyzed for mouse-specific IL-1β (Abcam cat.# ab197742, Cambridge, MA), IL-6 (Abcam cat.# ab222503), MCP-1 (Raybiotech cat.# ELM-MCP1-CL1), and TNF⍺ (Abcam cat.# ab208348) by ELISA.

Cell culture

The kidney endothelial cells were from a female (21-week old) donor. Preadipocytes were isolated from abdominal subcutaneous fat biopsies obtained from 10 subjects (3 male; 7 female; median age 44.3 ± 9.2 years; BMI 44.6 ± 9.2) who underwent gastric bypass surgery. All subjects gave informed consent. The protocol was approved by the Mayo Clinic Institutional Review Board for Human Research. Cells were isolated, cultured, and made senescent as previously described (12). Human primary renal glomerular endothelial cells, ScienCell (Cat #4000, Carlsbad, CA), Human Small Airway Epithelial Cells (Cat# CC-2547, Lonza), and HUVECs (Lonza, Cat #CC-2519, Basel, Switzerland) were purchased and cultured following manufacturer’s instructions. Cells were treated with S1 antigen (RayBiotech, Cat #230-30162-100, Peachtree Corners, GA), LPS from E.coli O111 :B4 purified by ion-exchange chromatography (Millipore Sigma, Cat#L3024), or antibodies for INF-α, for different durations as described in the manuscript. Briefly, senescent and non-senescent cells were treated with LPS for 3 hours. Cells were washed, and RNA was collected. Endothelial cells were treated with viral antigen for 24 hours, cells were washed and medium was replaced with fresh MEM containing 2% FBS for collecting conditioned medium (CM) after 24 hours. CM was filtered and cytokine and chemokine protein levels in CM were measured using Luminex xMAP technology. The multiplexing analysis was performed using the Luminex 100 system (Luminex, Austin, TX) by Eve Technologies Corp. (Calgary, Alberta, Canada). Human multiplex kits were from Millipore (Billerica, MA).

Cell culture with conditioned media (CM) and recombinant IL-1α

Non-senescent human primary renal glomerular endothelial cells were co-cultured with CM from senescent or non-senescent human primary renal glomerular endothelial cells with or without neutralizing antibodies for IL-1α (Catalogue #7D4 Anti-hIL-1α-IgG, InvivoGen, San Diego, CA), IL-18 (Catalogue #PA5-47803, Thermo-Fisher, Waltham, MA), and PAI1 (Catalogue #MAB1786, R&D system, Minneapolis, MN) for 48 hours, and cells were collected for qPCR. Non-senescent human primary renal glomerular endothelial cells were co-cultured with recombinant human IL-1α protein (Catalogue #200-LA-010, R&D Systems, Minneapolis, MN) for 48 hours and cells were collected for qPCR.

Lung biopsies

Methods for acquisition of human lung samples have been described previously (51, 52). Following pre-surgical patient consent, lung specimens were obtained from resections incidental to thoracic surgery at Mayo Clinic Rochester for clinical indications of focal, non-infectious causes (typically lobectomies, rarely pneumonectomies, for focal cancers). Normal lung areas were identified with a pathologist (protocol approved by the Mayo Clinic Institutional Review Board). Samples were formalin-fixed and paraffin-embedded for immunostaining and histology. Subjects used in this study were one female, four males, age 65.4 ± 10 years old (mean ± SD). The remaining clinical information was de-identified prior to immunostaining.

Immunostaining

Slides were rehydrated with xylene and decreasing concentrations of ethanol in water, blocked with endogenous peroxidase with 3% H2O2, and boiled for antigen retrieval in citrate buffer (pH 6.0). Sections were blocked with BSA 5% normal goat serum for 1 hour followed by overnight incubation with p16INK4a mouse anti-human antibody (Roche Diagnostic, Clone E6H4, #705-4793, ‎Rotkreuz, Switzerland). After washing in TBST buffer, sections were incubated in goat anti-mouse HRP antibody (Invitrogen, Cat #31430, Carlsbad, CA) for 30 min in blocking buffer and stained with TSA Cy5 (Akoya Biosciences, Cat #NEL745001KT, Menlo Park, CA) for 10 min. Antibodies were stripped with a second round of antigen retrieval in citrate buffer (pH 6.0) following the TSA manufacturer’s protocol. After blocking steps, slides were incubated with rabbit anti-human TMPRSS2 antibody (#ab92323, Abcam) for 12 hours, washed, and incubated with secondary goat anti-rabbit HRP antibody (#31460, Invitrogen) for 30 min followed by 10 min of TSA FITC (Akoya Biosciences Cat #NEL741001KT). Slides were mounted in Prolong Gold anti-fade with DAPI (Thermo-Fisher Cat #P36935).

Imaging

Imaging was performed using a Nikon T1 microscope (Nikon, Japan). A total of 10 images of the alveolar region of lungs were captured/slide. Background correction and intensity thresholding were defined using controls and applied to all samples using Advanced NIS Elements software (Nikon, Tokyo, Japan), with fine-adjustments for each subject’s background intensity. A total of 4-5 sections/slide with the best tissue integrity were selected for counting, and merged images were exported to ImageJ FIJI (9). We applied a centralized grid of 125 μm × 125 μm, generating 15 fields/section. TMPRSS2+ and p16INK4a+ cell counting markers were used to retrieve cell numbers in each square. The single-channel for DAPI was exported to ImageJ and the same 125 μm × 125 μm grid was applied, so nuclei could be counted in each square slice.

RNA extraction

Tissues were snap-frozen after harvest. RNA was extracted using Trizol after homogenization in a bead beater. After homogenization, chloroform was added to each sample. Samples were centrifuged to separate the aqueous layer. RNA was purified using columns (PureLink RNA Mini Kit Cat#12183018A) according to the manufacturer’s instructions.

Rt-pcr and qpcr

Each cDNA sample was generated by reverse transcription using 1-2000 ng RNA and by following the recommended protocol from the manufacturer (High-capacity cDNA Reverse Transcription Kit; Thermo-Fisher Cat #4368813). A standard reverse transcription program was used (10 min at 25°C, 120 min at 37°C, 5 min at 85°C, held at 4°C). qPCR was performed using Taqman Fast Advanced Master Mix (Thermo-Fisher, Cat# numbers listed in supplemental table S3) and probes or PowerUp SYBR Green Master Mix and primer pairs. Gapdh was used as a control for gene expression analysis. Data were analyzed using the ∆∆Ct method.

Statistical analysis

All data analyses were conducted in STATA 16.0 (College Station, TX : Stata Corp LLC). All figures were plotted using Prism 9.0 (GraphPad) or R 3.6.2. P value ≤ 0.05 was considered statistically significant.

To test the normality of the distribution of original variables (for analysis of variance and Student’s t-test) or residuals (for linear mixed model), skewness and kurtosis tests were performed accordingly (53). If the normality assumption was rejected (i.e. P < 0.05), we used zero-skewness log transformation (54). Then we performed the normality test again. If it was still rejected, we used a Box-Cox power transformation. If neither of these worked, we used rank transformation (i.e. using the rank of the original variable) instead (55). Student’s t-test was used to compare the equality of means from two independent samples, while one-way ANOVA was used to compare means from multiple samples. Two-way ANOVA was used when there were two predictors and above. A linear mixed model was used if there was non-independence within individuals or experiments. Tukey HSD test was used for post-hoc multiple-comparison after one- or two-way ANOVA (56, 57). In the case of mixed-effect models, “margins” command was used to calculate statistics from predictions of the fitted model at fixed values of some predictors (e.g. treatment and type of cells). Partial Pearson correlation and linear regression, both with adjustment for strain ID, were performed to examine the association between TMPRSS2+ and p16INK4a+. To assess whether the SASP factors changed as a group, we created a composite score for each individual, which is the average z-score of the involved factors and performed the mixed effect model using the composite score as the outcome to assess whether the SASP factors changes as a group varied across covariates (58)CompositeScorei=∑j=1mizijmiwhere zij is the z-score of transformed values (by either log-transformed, Box-Cox transformed, or rank transformed) of SASP factor j for individual i, respectively. mi is the number of observed factors for individual i. For survival data, Kaplan-Meier survival curves were used to describe the survival process, which was followed by a log-rank test for assessing the equality of survivor functions between groups if there was only one predictor, or a Cox proportional hazards model if there were two predictors. Interaction between two predictors (e.g. treatment and type of cells) was considered in the above analyses if the original design was a factorial one. Acknowledgments: Financement: This work was supported by NIH grants RO1 AG063543-02S1 (LJN, PDR, SEH, CDC, SCJ), P01 AG043376 (PDR, LJN), U19 AG056278 (PDR, LJN), RO1 AG063543 (LJN, PDR), P01 AG062413 (SK, JLK, TT, NKL, LJN, PDR), R37 AG013925 (JLK, TT), P30 AG050886 and U24 AG056053 (DBA), P30 CA077598 (MGO), K08 CA215105 (AM), R01 AI116678 (SEH, SCJ), R00 AG058800 (CDC), R01 AG053832 (NKL), the Paul F. Glenn Center for Biology of Aging Research at Mayo Clinic (NKL), the Glenn Foundation (LJN), the Connor Fund (JLK, TT), Robert P. and Arlene R. Kogod (JLK), Robert J. and Theresa W. Ryan (JLK, TT), the Noaber Foundation (JLK, TT), the University of Minnesota Clinical and Translational Science Institute (CDC, PDR, SEH), the University of Minnesota Medical School award AIRP2-CP-21 (SCJ, SEH, LJN) and the Medical Discovery Team on the Biology of Aging (LJN, CDC, PDR). MJY is supported by The Irene Diamond Fund/American Federation on Aging Research Postdoctoral Transition Award. CDC is supported by the Fesler-Lampert Chair in Aging Studies and an AFAR Junior Faculty Award. We are grateful to Kylie Frohmader for assistance with the in vivo LPS experiments. In addition, we acknowledge the excellent technical support of P. Overn and K. Kovacs from the UMN Comparative Pathology Shared Resource Laboratory. Author contributions: PDR, LJN, JLK and TT generated the overall concept of the study. MJY, LZ, LL, YZ, CDC, RDO, SHC, MAH, MP, NG, TP, AX, UT, EJA, CLI, KOJ, JMEN, AM, and ML performed experiments in this study. KJ and CI bred, genotyped, and pre-treated INK-ATTAC mice. TWC and MGO did the histopathology. YSP provided human lung tissue. SEC provided primary human epithelial cells. DAB, PX, and KE performed the statistical analysis. CDC, MJY, YZ, NKL, SK, SCJ, SEH, TT, JLK, PDR, and LJN designed the study and wrote the manuscript. All authors read, edited, and approved the final version of the manuscript. Competing interests: Patents on INK-ATTAC mice are held by Mayo Clinic. Patents and pending patents on senolytic drugs and their uses are held by Mayo Clinic (JLK, TT, YZ, NKL) and the University of Minnesota (LJN, PDR). This research has been reviewed by the Mayo Clinic Conflict of Interest Review Board and was conducted in compliance with Mayo Clinic and University of Minnesota Conflict of Interest policies. LJN and PDR are co-founders of NRTK Biosciences, a startup focused on the development of novel senolytics. LJN has consulted for Merck and Ono Pharma on senescent cells as a therapeutic target. JLK is a member of the Scientific Advisory Board for Elysium Health, marketing dietary supplements, LJN and PDR are on the Scientific Advisory Board for Innate Biologics, developing bacterial effector proteins, and PDR is on the Scientific Advisory Board for L & J Bio, developing therapeutics for neurodegeneration. PDR also is co-founder and member of the Scientific Advisory Board for Genascence Corporation, a gene therapy company focused on osteoarthritis. DBA has received personal payments or promises for same from : American Society for Nutrition; Alkermes, Inc. American Statistical Association; Amin Talati Wasserman and Glanbia; Big Sky Health, Inc. Biofortis; California Walnut Commission; Clark Hill PLC; Columbia University; Fish & Richardson, P.C. Frontiers Publishing; Henry Stewart Talks; Indiana University; Johns Hopkins University; Kaleido Biosciences; Law Offices of Ronald Marron; Medical College of Wisconsin; Medpace/Gelesis; National Institutes of Health (NIH); National Academies of Science; Novo Nordisk Fonden; Sage Publishing; Sports Research Corp. The Obesity Society; The Elements Agency, LLC; Taylor and Francis; Tomasik, Kotin & Kasserman LLC; University of Alabama at Birmingham; University of Miami; Nestle; and WW (formerly Weight Watchers International, LLC). Donations to a foundation have been made on his behalf by the Northarvest Bean Growers Association. Data and materials availability : All data are available in the main text or the supplementary materials. The INK-ATTAC mice are available from JLK and TT under a material transfer agreement. The Ercc1−/Δ mice require an MTA with Erasmus Medical Center, Rotterdam, NL. This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0) license, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. To view a copy of this license, visit https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. This license does not apply to figures//artwork or other content included in the article that is credited to a third party; obtain authorization from the rights holder before using such material.