Des profils inflammatoires distincts distinguent le COVID-19 de la grippe avec des contributions limitées de la tempête de cytokines

INTRODUCTION

L'infection par le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) provoque une maladie à coronavirus 2019 (COVID-19). Une insuffisance respiratoire aiguë survient chez un sous-ensemble de patients atteints de COVID-19 (1–3). Une insuffisance respiratoire est survenue chez jusqu'à 8% des personnes testées positives pour l'infection dans la région de Lombardie en Italie (4). Comprendre l'étiologie de l'insuffisance respiratoire chez les patients atteints de COVID-19 est essentiel pour déterminer les meilleures stratégies de gestion et les cibles pharmacologiques pour le traitement. La prise en charge actuelle de l'insuffisance respiratoire aiguë dans le COVID-19 consiste en des soins de support optimisés (5, 6), principalement par l'administration d'oxygène et la prise en compte de l'intubation endotrachéale et de la ventilation mécanique dans le contexte approprié (7). Des preuves récentes publiées dans l'essai RECOVERY (Randomized Evaluation of COVID-19 Therapy) (8) suggèrent que l'administration de stéroïdes à forte dose dans un petit sous-groupe de patients gravement malades peut réduire la mortalité.

Le syndrome de tempête de cytokines (CSS) a été proposé comme sous-jacent à l'étiologie de l'insuffisance respiratoire chez les patients atteints de COVID-19 (9). Ce modèle suggère que l'insuffisance respiratoire est liée à une expression significative de cytokines pro-inflammatoires qui conduit à un recrutement de cellules inflammatoires et à des lésions tissulaires dans les poumons. La plupart des données étayant cette hypothèse dans COVID-19 proviennent d'un premier article qui a observé des niveaux élevés de cytokines interleukine-2 (IL-2), IL-7, IL-10, facteur de stimulation des colonies de granulocytes (G-CSF) , Protéine 10 induite par l'interféron γ (IP-10), protéine chimioattractive monocytaire 1 (MCP1), protéine inflammatoire macrophage – 1α (MIP-1α) et facteur de nécrose tumorale α (TNFα) dans une petite cohorte de patients atteints de COVID-19 être pris en charge dans l'unité de soins intensifs (USI). Le niveau de ces cytokines a été augmenté chez les patients en USI par rapport à un groupe de patients atteints de COVID-19 qui ne nécessitaient pas de soins en USI (3). L'hypothèse CSS pour l'insuffisance respiratoire dans COVID-19 a récemment été contestée, car d'autres ont examiné de plus près les données des premières études sur l'expression des cytokines chez les patients atteints de COVID-19 (10). La CSS, bien qu'elle ne soit pas spécifiquement définie, est clairement observée dans des conditions telles que la lymphohistiocytose hémophagocytaire (11), les cas graves de grippe aviaire (12), la maladie de Castleman (13) et le syndrome de libération de cytokines observé chez un sous-ensemble de patients suivant un antigène chimérique thérapie par les cellules T des récepteurs pour la malignité (14). Dans ces cas de véritable CSS, les taux sanguins circulants de plusieurs cytokines sont généralement plus de 10 fois supérieurs aux niveaux de base et démontrent généralement un biais vers un profil de réponse cytokine de type T helper 1 (TH1) suggérant une réponse accrue des lymphocytes T. Les niveaux d'expression des cytokines rapportés dans les études sur des patients atteints de COVID-19, bien qu'augmentés chez les personnes atteintes d'une maladie grave, ne sont élevés que marginalement, moins de deux fois supérieurs à ceux observés chez les sujets non gravement malades (3). Très peu d'études comparent les réponses inflammatoires du COVID-19 à celles observées dans d'autres maladies virales qui conduisent à une insuffisance respiratoire aiguë, comme la grippe (15).

Il y a eu un intérêt significatif pour la modulation de la réponse immunitaire systémique dans un effort pour prévenir ou traiter l'insuffisance respiratoire chez les patients atteints de COVID-19 (2, 8, 16–18). Plus de 100 essais cliniques sont actuellement enregistrés sur Clinicaltrials.gov pour évaluer l'efficacité des médicaments bloquant les cytokines inflammatoires ou des interventions telles que la filtration des cytokines en tant que traitements potentiels de l'insuffisance respiratoire chez les patients atteints de COVID-19. L'étude RECOVERY dexaméthasone suggère un bénéfice de mortalité pour la thérapie d'immunomodulation dans un sous-ensemble de patients gravement malades atteints de COVID-19 (8). Une compréhension approfondie de l'environnement inflammatoire sous-jacent chez les patients atteints de COVID-19 est nécessaire pour sélectionner avec soin les patients pour ces études de traitements potentiels, en particulier à la lumière de l'augmentation (bien que non statistiquement significative) du taux de mortalité observé chez les patients sans besoin en oxygène qui ont reçu de la dexaméthasone dans le cadre de l'essai RECOVERY.

Pour comprendre la relation entre les réponses inflammatoires de l'hôte et l'insuffisance respiratoire observée chez les patients atteints de COVID-19, nous avons entrepris une étude comparative des réponses inflammatoires dans une cohorte de patients grippaux atteints d'une maladie sévère recueillie en 2019-2020, ce qui nous a permis de caractériser le système immunitaire. réponse chez les patients atteints de COVID-19 sévère, spécifiquement dans le contexte des réponses immunitaires plus largement étudiées observées dans les maladies respiratoires causées par la grippe. Ces comparaisons révèlent que, malgré les hypothèses dominantes dans la littérature, le CSS est relativement rare parmi les infections à COVID-19 modérées et sévères; plutôt, la plupart des patients atteints de COVID-19 dans l'étude actuelle présentaient des profils immunitaires supprimés par rapport aux modèles observés chez les patients infectés par la grippe.

RÉSULTATS

Caractéristiques démographiques et cliniques

Nous avons recruté un total de 79 sujets symptomatiques dans la cohorte initiale (primaire) qui ont été testés positifs pour l'ARN du SRAS-CoV-2 à l'aide d'un test de réaction en chaîne par polymérase clinique (PCR) approuvé par la Food and Drug Administration. Notre groupe de comparaison était composé de 26 sujets symptomatiques de la grippe saisonnière recrutés au cours de la période de 15 mois précédant immédiatement l'épidémie de COVID-19 dans la région de Saint Louis, tous testés positifs pour la grippe A ou B via un test PCR clinique obtenu au cours de leur clinique. se soucier. Les sujets COVID-19 étaient, en moyenne, 19 ans plus âgés que les sujets grippaux et 29 ans plus âgés que les sujets témoins (tableau 1). Un plus grand nombre de sujets COVID-19 ont nécessité une hospitalisation, une admission aux soins intensifs et une ventilation mécanique que les sujets grippaux, mais ce n'était pas significativement différent après contrôle des facteurs démographiques et d'autres caractéristiques cliniques. Vingt-sept pour cent des sujets COVID-19 sont décédés au cours de leur hospitalisation, contre 8% des sujets grippaux inscrits. De nombreux sujets des groupes grippaux et COVID-19 présentaient des comorbidités qui augmentaient leur risque de maladie grave, y compris le diabète et la maladie pulmonaire chronique; cependant, il n'y avait aucune différence significative entre le COVID-19 et les sujets grippaux dans aucune comorbidité analysée (tableau 1). Les cohortes COVID-19 et grippales comprenaient des sujets atteints d'une maladie modérée, telle que définie par des personnes présentant une maladie symptomatique nécessitant une évaluation à l'hôpital, et une maladie grave, telle que définie par des personnes nécessitant une ventilation mécanique pour une insuffisance respiratoire aiguë ou qui sont finalement décédées des suites de leur maladie. .

Tableau 1 Données démographiques et caractéristiques cliniques de la cohorte primaire.

Les analyses statistiques de la démographie de la cohorte primaire comprennent des comparaisons entre le COVID-19 et les groupes en bonne santé pour l'âge, le sexe et l'ethnicité à l'aide d'une régression logistique multinomiale qui inclut la variation des individus infectés par la grippe. Les comparaisons entre les groupes COVID-19 et grippaux ont été évaluées à l'aide d'une régression logistique multivariée qui incluait des variables démographiques et cliniques, mais sans inclure la variation par rapport au groupe sain, car les caractéristiques cliniques n'étaient pas pertinentes pour les témoins sains. Les résultats sont rapportés sous forme de valeur P correspondante et, lorsqu'ils sont significatifs, incluent le rapport de cotes (OR). Le COVID-19 sert de condition de référence dans toutes les analyses, «Afro-américain» sert de référence pour les comparaisons ethniques et l'indication négative sert de référence pour toutes les caractéristiques cliniques catégoriques. Un OR> 1 significatif indique une association positive entre le groupe de comparaison et la variable (par exemple, les individus en bonne santé étaient plus susceptibles de s'auto-identifier comme étant caucasiens que les patients atteints du SRAS-CoV-2), alors qu'un OR significatif 2 ET par rapport à la moyenne pour plus de 17 des 35 cytokines mesurées (intervalle: 49 à 89%), englobant des réponses immunitaires larges et non focalisées caractéristiques de la tempête de cytokines classique (voir valeurs aberrantes; fig. S2 ). Les tempêtes de cytokines dans d'autres conditions ont été définies par des écarts extrêmes dans les niveaux d'un large éventail de cytokines plutôt que par de simples élévations modérées des voies ciblées (19). Les ET de la moyenne variaient de 2 à 10,5 chez ces sujets CSS, avec des valeurs aberrantes allant de 0,8 à 2 ordres de grandeur plus élevées que la moyenne pour chacune des cytokines mesurées. Les patients atteints de CSS étaient tous afro-américains, une femme (89 ans) sans comorbidités notées, une femme (62 ans) atteinte de diabète sucré et un homme (47 ans) souffrant de diabète sucré et d'une maladie pulmonaire chronique préexistante (tableau S1). Les trois patients atteints de CSS ont été admis à l'USI, ont nécessité une intubation et une ventilation mécanique et ont finalement expiré. Dans des analyses ultérieures, ces trois patients ont été visualisés et analysés en tant que groupe CSS distinct, sauf indication contraire. Parmi les 76 échantillons COVID-19 restants de cette cohorte primaire, les patients présentaient souvent des valeurs en dehors de 1,5 plages interquartiles pour les cytokines individuelles (fig. S3), suggérant l'activation de voies spécifiques; cependant, la grande majorité des niveaux individuels de cytokines de chaque patient se situaient bien dans la majorité de la variation observée, ce qui ne supporte pas la large dérégulation des cytokines attendue dans un phénotype CSS.

Fig. 2 Augmentation de la régulation sélective des cytokines chez les patients atteints de COVID-19 de la cohorte primaire.

(UNE) En haut: PCA de 35 cytokines mesurées chez des sujets COVID-19 de la cohorte primaire. Cercles rouges: patients atteints de CSS; points verts: tous les autres sujets. Les échantillons avec des données manquantes sur les cytokines ont été exclus. En bas: charges PCA correspondantes indiquant les effets de chaque cytokine. (B) Graphique de l'abondance relative des cytokines, chaque cytokine étant normalisée au niveau médian respectif des cytokines chez les sujets grippaux. Le niveau médian normalisé de cytokines chez les patients grippaux (1,0) est représenté par la ligne bleue verticale. Les graphiques à barres représentent le niveau médian normalisé de cytokines COVID-19 par rapport au niveau médian normalisé de cytokines grippales. Barres rouge clair: taux de cytokines plus faibles chez COVID-19 que chez les patients grippaux (médiane normalisée < 1, n = 28); dark red bars: cytokines levels greater in patients with COVID-19 than in patients with influenza (normalized median > 1, n = 7). (C) Les diagrammes en boîte montrent les concentrations de cytokines chez des sujets sains, grippaux, COVID-19 et CSS, les valeurs brutes étant tracées sur l'échelle log10. Les valeurs de P proviennent de comparaisons de moyennes marginales estimées (EMM), faisant la moyenne de tous les facteurs démographiques et cliniques inclus comme covariables et ajustées pour des comparaisons multiples. À droite de chaque boîte à moustaches se trouvent des graphiques EMM pour la comparaison grippe-COVID-19. Point noir: moyenne marginale estimée de la concentration log10 de la cytokine, moyennée sur les niveaux de toutes les autres covariables; ombrage bleu: intervalle de confiance correspondant à 95%; flèches rouges: SE dans une direction, avec des flèches SE se chevauchant indiquant aucune différence significative entre l'EMM d'une cytokine donnée chez les sujets grippaux par rapport aux sujets COVID-19.

Nous et d'autres avons déjà montré que de nombreuses cytokines sont souvent corrélées à des facteurs démographiques et environnementaux (par exemple, l'âge et une exposition antérieure à l'herpèsvirus) (20). Pour évaluer les différences de cytokines entre les groupes tout en contrôlant ces facteurs de confusion potentiels, y compris les différences d'âge significatives observées au sein de notre cohorte, nous avons généré des moyennes marginales estimées à partir de modèles de régression linéaire intégrant l'âge, le sexe, l'origine ethnique, les jours depuis le début des symptômes lors de l'inscription, et toutes les comorbidités rapportées comme covariables. Par rapport aux témoins sains, les sujets grippaux et COVID-19 ont présenté des niveaux élevés d'un certain nombre de cytokines. Parmi les patients atteints de COVID-19, IP-10, IL-8, MCP1, HGF (facteur de croissance hépatocytaire) et MIP-1β étaient significativement régulés à la hausse par rapport aux témoins sains, en plus des tendances apparentes (mais non statistiquement significatives) d'augmentation. dans MIG (monokine induite par l'interféron gamma), granulocytes-macrophages CSF (GM-CSF), IL-1RA, IL-2, IL-17f et IL-6 (Fig. 2B et Fig. S3). Par rapport aux témoins sains, les patients infectés par la grippe ont également présenté une régulation positive significative de toutes les cytokines régulées à la hausse chez les patients atteints de COVID-19, mais les patients infectés par la grippe présentaient également des abondances significativement plus importantes (par rapport aux patients infectés par le COVID-19) d'un certain nombre de cytokines avec des rôles inflammatoires et immunomodulateurs connus, y compris MIG, IL-1RA, IL-2R, IL-2, IL-17f et IL-12 (fig. S3).

Pour élucider les façons uniques dont le COVID-19 module les profils de cytokines, nous avons axé la majorité des analyses de cytokines sur des comparaisons entre les groupes COVID-19 et grippaux. Des comparaisons directes entre les groupes infectés ont révélé que le profil de réponse dominant chez les patients atteints de COVID-19 consistait en une régulation à la hausse des cytokines plus sélective, avec un biais relatif vers une inflammation plus faible par rapport aux patients atteints de grippe (Fig.2, B et C). Parmi tous les sujets, nous avons constaté que pour 28 des 35 cytokines, les patients atteints de COVID-19 avaient des niveaux médians de cytokines inférieurs, bien que tous n'étaient pas statistiquement significatifs (Fig. 2B et Fig. S3). Parmi les cytokines réduites statistiquement significatives présentées par les patients atteints de COVID-19 par rapport aux patients grippaux figuraient l'interféron-γ (IFN-γ), MIG, IL-1RA, IL-2R, G-CSF, IL-17a, IL-9 et MIP-1α. Lors de l'inspection visuelle des données brutes, l'IL-6 et l'IL-8 semblaient être plus importantes chez les COVID-19 que chez les patients infectés par la grippe, mais la moyenne marginale estimée de l'une ou l'autre des cytokines était significativement différente après contrôle des covariables (Fig.2C et fig. S3 et S4), en particulier les effets de l'âge, du sexe et des maladies pulmonaires préexistantes. Cette découverte est particulièrement pertinente dans la discussion en cours sur les profils de cytokines COVID-19: bien que certaines cytokines semblent être plus élevées chez les patients atteints de COVID-19, ces différences sont potentiellement gonflées par d'autres différences démographiques et cliniques sous-jacentes. Par exemple, les patients hospitalisés atteints de COVID-19 sont généralement plus âgés [Table 1; (21)], et de nombreux niveaux de cytokines de base augmentent avec l'âge (22, 23). En tenant compte de ces facteurs de confusion et d'autres, les données ont indiqué que la plupart des patients atteints de COVID-19 n'avaient pas un phénotype inflammatoire aussi profond que les patients atteints de grippe, avec certaines exceptions ciblées.

Validation des profils de cytokines COVID-19 dans une cohorte supplémentaire SARS-CoV-2

Pour valider les profils de cytokines observés parmi les groupes témoins COVID-19, grippaux et sains de notre cohorte principale, nous avons recruté une cohorte de suivi composée des 89 patients confirmés consécutifs avec COVID-19 inscrits dans l'étude observationnelle prospective en cours ( Tableau 2). Les données sur les cytokines de ces patients ont été collectées et analysées comme décrit pour la cohorte principale. Parmi les 89 patients de la cohorte de validation, quatre présentaient une variation marquée de leurs profils de cytokines (Fig. 3A, cercles rouges) qui, bien que moins extrêmes que ceux de la cohorte primaire, étaient cohérents avec un phénotype CSS (Fig. S5). Ces échantillons ont été caractérisés par des taux de cytokines> 2 ET par rapport à la moyenne pour plus de 9 des 35 cytokines mesurées (intervalle: 26 à 49%). Deux de ces patients se sont auto-identifiés comme afro-américains (femme de 59 ans, homme de 71 ans), un comme «autre» (homme de 41 ans) et un comme blanc (64 ans) Masculin). Les deux patients afro-américains atteints de CSS avaient déjà reçu un diagnostic de diabète sucré, et la femme de 59 ans avait également reçu un diagnostic d'insuffisance cardiaque chronique et de maladie pulmonaire chronique et était immunodéprimée. Les autres patients atteints de CSS n'avaient pas de comorbidités répertoriées. Le patient de sexe masculin de 64 ans a été admis à l'USI, a nécessité une intubation et une ventilation mécanique et a finalement expiré. Aucun des trois autres patients atteints de CSS n'a été intubé et tous ont finalement survécu. Contrairement à ces profils CSS, un autre sous-ensemble de trois patients présentait un profil unique avec une signature TH22 classique (Fig.3A, cercles bleus), consistant en la production de niveaux élevés d'IL-22, de GM-CSF et d'IL-13 sans niveaux élevés d'IL-17. Tous les patients avec une signature TH22 étaient des femmes afro-américaines (âgées de 19, 26 et 71 ans) sans comorbidités répertoriées. Aucun n'a nécessité d'intubation et tous ont survécu. Bien que les échantillons présentant la signature TH22 soient tracés séparément pour une comparaison visuelle, ils ont été considérés comme représentant des réponses cytokines régulées et ont donc été inclus comme échantillons de validation COVID-19 dans toutes les analyses statistiques.

Tableau 2 Données démographiques et caractéristiques cliniques de la cohorte de validation avec comparaisons avec les sous-ensembles de la cohorte principale.

Les analyses statistiques de la démographie de la cohorte de validation comprennent des comparaisons entre les groupes de validation et les groupes sains pour l'âge, le sexe et l'ethnicité à l'aide d'une régression logistique multinomiale qui inclut la variation des individus infectés par la grippe. Les comparaisons entre la cohorte de validation et les deux groupes de patients de la cohorte principale (COVID-19 et grippe) ont été évaluées à l'aide d'une régression logistique multivariée qui comprenait des variables démographiques et cliniques. Les résultats sont rapportés sous la forme de la valeur P correspondante et, lorsqu'ils sont significatifs, incluent le OR. La cohorte de validation sert de condition de référence dans toutes les analyses, l'Afro-américain sert de référence pour les comparaisons ethniques et l'indication négative sert de référence pour toutes les caractéristiques cliniques catégoriques. Un OR significatif> 1 indique une association positive entre le groupe de comparaison et la variable (par exemple, les patients atteints de COVID-19 de la cohorte principale étaient plus susceptibles d'être intubés que les patients de la cohorte de validation atteints de COVID-19), alors qu'un OR significatif