Pour prévenir de futures pandémies, les scientifiques doivent recueillir autant d'informations que possible sur le coronavirus. Auparavant, le MERS et le SRAS sont plus mortels que le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) mais ont un faible taux de transmission. D'autre part, le SRAS-CoV-2 s'est propagé plus rapidement parmi les humains mais présente un risque de décès inférieur à celui des deux autres virus. Le développement de futurs traitements contre les coronavirus nécessitera une meilleure compréhension des interactions virus-hôte.
Lei S. Qi de l'Université de Stanford, en Californie, et ses collègues ont publié des recherches montrant un cadre potentiel pour mieux caractériser la biologie des coronavirus. Alors que la plupart des techniques d'imagerie à haute résolution montrent le cycle de vie des coronavirus, l'identification des protéines et des génomes viraux ou hôtes reste mal comprise. Leurs résultats utilisent une imagerie super-résolution multicolore qui leur permet d'étudier des parties nanoscopiques du coronavirus, y compris l'ARN.
Les auteurs écrivent :
« De manière générale, nous prévoyons que les efforts futurs appliqueront des techniques d'imagerie SR avancées en 3D ainsi que la combinaison de l'imagerie à molécule unique et de la tomographie cryoélectronique pour atteindre une résolution nanométrique et une spécificité moléculaire exquise simultanément pour la recherche en virologie. »
L'étude "Multi-color super-resolution imaging to study human coronavirus RNA during cellular infection" a récemment été publiée sur le serveur de préimpression bioRxiv*.
Comment ils ont fait
Les chercheurs ont combiné la microscopie confocale et à super-résolution pour créer un cadre d'imagerie par fluorescence multicolore et multi-échelle. L'outil est conçu pour visualiser les interactions spatiales entre les ARN viraux et différentes zones de cellules hôtes à différents stades de l'infection virale.
Cette étude a utilisé le modèle de coronavirus HCoV-229E pour caractériser différentes structures d'ARN de guidage pendant l'infection.
Résultats
L'utilisation de la nouvelle technique de microscopie a permis aux chercheurs d'observer des amas irréguliers et étendus en forme de toile d'ARN guide pendant l'infection. Les grappes se sont étendues à mesure que l'infection virale progressait avec le potentiel de croître jusqu'à 9 microns carrés.
L'ARNdb forme des puncta séparés du RE tandis que les clusters d'ARNg s'associent fréquemment à la reconstruction SR bicolore du RE (A) d'une cellule à 24 h p.i. où le RE (gris) et les ARNdb (vert) sont marqués. Barre d'échelle : 5 m. (B) Zoom avant de la région encadrée. L'ARNdb forme des points compacts qui apparaissent dans des régions en dehors du réseau du RE. (C) Reconstruction SR bicolore d'une cellule où le RE (gris) et l'ARNg (magenta) sont marqués. Barre d'échelle : 5 m. (D) Zoom-ins de la région encadrée verte. L'ARNg forme des amas de différentes tailles, dont certains présentent des limites mal définies. Le réseau étendu de clusters est souvent étroitement associé à la membrane du RE. (E) Une population de l'ARN génomique forme de petits puncta de tailles similaires qui ne sont pas associés au RE (cf. Figure 3). (F) Reconstruction SR à une couleur de l'ARNg à 12 h p.i. En médaillon : image DL du même champ de vision. Barre d'échelle : 5 µm. La barre de couleur indique le nombre de détections de molécules uniques dans chaque pixel. (GI) Zooms sur les régions encadrées colorées. De grands amas du génome viral apparaissent périnucléaires et s'étendent jusqu'à quelques microns.
Les chercheurs ont observé environ 70 nm d'ARN guide dans la cellule tout au long de l'infection.
"Alors qu'une fraction de ces points peut être de l'ARNg libre localisé loin du RE, de tels objets devraient apparaître plus gros en raison du marquage d'une région de 3000 pb. Combiné avec la rareté observée de ces objets, nous pouvons raisonnablement supposer qu'un grand fraction de ces puncta nanométriques sont des virions », a écrit l'équipe.
En effet, l'ARN guide est apparu à des densités plus élevées et peut indiquer des paquets de vésicules avec des virions potentiels.
Les résultats ont également capturé un ARN double brin plus gros qui a formé des points lacrymaux larges et de forme circulaire d'environ 450 nm de diamètre. Au fur et à mesure que l'infection virale progressait, le nombre de points d'ARN double brin a également augmenté. Cependant, la taille des points lacrymaux d'ARN double brin est restée constante. Sur la base des observations et de la forme circulaire de l'ARN, les chercheurs suggèrent que les points lacrymaux se trouvent probablement dans les membranes lipidiques des vésicules à double membrane.
Modèle basé sur SR de la distribution de l'ARNg et de l'ARNdb du HCoV-229E Un modèle montrant l'organisation spatiale d'une cellule infectée par le HCoV-229E. La membrane ER est modifiée pour créer à la fois des membranes alvéolées et des DMV. De grands amas d'ARNg ont été trouvés en association avec la membrane du RE, tandis que les virions emballés qui apparaissent comme des points gRNA nanométriques bien séparés ne sont souvent pas connectés au RE. Les DMV sont remplis d'ARNdb à des degrés divers. Certains DMV sont toujours attachés à la membrane du RE, tandis que d'autres ont bourgeonné. Ces DMV sont séparés de la membrane alvéolée, où les clusters d'ARNg semblent être les produits d'une réplication active.
L'ARN double brin n'a pas colocalisé avec le réticulum endoplasmique (RE). Les résultats ont montré que les points lacrymaux situés à plus de cent nanomètres du signal du RE étaient probablement coupés du reste de la zone - suggérant que l'ARN double brin à côté du RE pourrait indiquer des vésicules à double membrane bourgeonnant de la membrane du RE.
"Il est intéressant de noter que les points ARNdb n'ont pas été visualisés par le marqueur de la protéine membranaire du RE que nous avons utilisé dans cette étude, ce qui suggère que la composition et donc la propriété de la membrane virale manipulée peuvent être différentes du reste du RE, ou du rayon de courbure élevé du Les DMV ou la membrane est trop densément peuplée de protéines virales excluant le marqueur à passage unique natif du RE."
Les virions marqués à l'échelle nanométrique par l'ARN puncta avaient tendance à n'avoir aucun signal d'ARN double brin voisin. Bien qu'ils ne soient pas colocalisés, de grands amas d'ARN guide drapés de points d'ARN double brin à la frontière ont été notés.
Lorsque le virus a été exposé au remdesivir, il a diminué le signal fluorescent confocal de l'ARN guide et double brin. Le remdesivir a également diminué le côté médian des grappes d'ARN guide. En revanche, la taille médiane des points lacrymaux d'ARN double brin a augmenté.
Les résultats ouvrent la voie à d'autres voies de recherche sur la façon dont l'ARN est libéré des vésicules à double membrane pour l'assemblage ou la traduction de virions. Les résultats confirment l'utilité de l'imagerie super-résolution de fluorescence multicolore pour étudier ces questions.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique/le comportement lié à la santé, ou traités comme des informations établies.
