Les cellules T CD8+ spécifiques des épitopes de coronavirus conservés sont en corrélation avec une maladie plus bénigne chez les patients COVID-19

INTRODUCTION

Le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2), le virus à l'origine du COVID-19, a infecté ∼ 120 millions de personnes dans le monde, présentant un spectre de gravité de la maladie allant de la pneumonie asymptomatique à la pneumonie potentiellement mortelle et à la défaillance multiviscérale ( 1). Face à cette pandémie mondiale, de nombreuses sociétés pharmaceutiques et laboratoires de recherche se sont précipités pour développer des vaccins efficaces contre les coronavirus, dont plus d'une centaine sont en cours de développement (2). L'objectif principal de la plupart des efforts de développement de vaccins est la génération d'anticorps neutralisants ciblant la protéine de pointe (S) du SRAS-CoV-2.

Cependant, l'ampleur variable et la durabilité de ces réponses anticorps chez les patients COVID-19 soulignent l'importance d'étudier l'immunité à médiation par les cellules T pour mieux comprendre la pathogenèse de la maladie et pour développer des références pour une réponse efficace des cellules T (3-6). De nombreuses études ont montré que les cellules T sont impliquées dans une infection par le SRAS-CoV-2 (7-13), mais quels types de réponses sont efficaces et lesquels ne le sont pas ne sont pas clairs.
La majorité des cellules T chez la plupart des mammifères, y compris les êtres humains, expriment le récepteur des cellules T (TCR) et reconnaissent un peptide particulier lié à une molécule du complexe majeur d'histocompatibilité (pMHC) exprimée sur les cellules cibles (14).

La faible constante de dissociation à l'équilibre (KD 1-200μM) entre le TCR et le pMHC monomère entraîne un complexe transitoire qui empêche une détection facile (15). Le développement de la technologie pMHC-tétramère (« tétramère »), dans laquelle la conjugaison de quatre molécules de pMHC à la streptavidine (SAv) entraîne une avidité accrue de liaison au TCR, a jeté les bases pour contourner ce problème (16). Depuis lors, plusieurs études ont augmenté la valence des multimères pMHC pour améliorer la capacité de ces réactifs à détecter les cellules T avec une affinité marginale (17-19), tels que les dextramères pMHC qui utilisent des polymères de dextrane pour augmenter le nombre de pMHC.

Cependant, la détection des TCR de faible affinité reste difficile, en partie en raison d'un bruit de fond accru provenant de la coloration non spécifique utilisant des plates-formes de valence plus élevées, ce qui a un impact négatif sur le rapport signal sur bruit (19-21).
Afin d'améliorer ces limitations, nous avons conçu un site de biotinylation sur la maxi-ferritine pour créer un échafaudage protéique auto-assemblant de 24 sous-unités pour l'affichage multivalent de pMHC. Cette plate-forme « sphéromère » offre plusieurs avantages : facilité de production, conjugaison spécifique au site définie des molécules pMHC qui réduit considérablement la variation entre les lots et compatibilité avec les molécules pMHC et les réactifs streptavidine actuellement disponibles permettant une traduction facile.

Nous montrons que le sphéromère se lie à la fois aux cellules T restreintes au MHC-I et au MHC-II avec une excellente spécificité pour le pMHC, et à une avidité significativement plus élevée que le tétramère. De plus, ce réactif fournit un meilleur rapport signal sur bruit et détecte un répertoire de TCR spécifique à l'antigène beaucoup plus diversifié par rapport aux tétramères ou dextramères équivalents. Enfin, en utilisant le sphéromère pour une étude ex vivo directe des cellules T CD8+ spécifiques du SRAS-CoV-2, nous montrons que les cellules T prédisant une réaction croisée avec les coronavirus humains saisonniers sont considérablement enrichies chez les patients COVID-19 présentant des symptômes légers par rapport aux individus avec une maladie grave.

Puisqu'il existe des preuves que les anticorps anti-SARS-CoV-2 commencent à diminuer peu de temps après l'infection (3, 5), ces cellules T robustes aux épitopes conservés détectés chez les individus non exposés au SRAS-CoV-2 et chez ceux atteints d'une maladie bénigne pourraient être le déterminant clé dans une réponse immunitaire adaptative réussie et pourrait aider à expliquer la disparité dans les résultats de COVID-19. De plus, suivre ces cellules T à l'aide de la technologie des sphéromères pourrait aider à suivre l'immunité contre le SRAS-CoV-2 chez les individus vaccinés, en particulier dans le contexte des souches mutantes émergentes du SRAS-CoV-2 qui, dans certains cas, échappent aux réponses anticorps induites par le vaccin (22).

RÉSULTATS

Dans la recherche d'un échafaudage protéique qui pourrait augmenter la valence du pMHC affiché et qui, espérons-le, capturerait plus de cellules T d'une spécificité donnée, nous nous sommes concentrés sur les homo-oligomères auto-assemblés (Illustration S1A) (23, 24).

Basé sur le rendement et l'homogénéité des protéines exprimées de manière recombinante (Fig. S1B-C), nous avons choisi la maxi-ferritine pour une optimisation plus poussée. Les ferritines sont des protéines cages naturelles qui participent à la synthèse biominérale et sont présentes dans presque tous les organismes vivants (23).

Des études ont montré que les protéines thermophiles se dénaturent à une température beaucoup plus élevée que leurs homologues mésophiles (25). Par conséquent, nous avons utilisé de la ferritine dérivée de l'anaérobie archéen hyperthermophile Pyrococcus furiosus pour développer un échafaudage stable. La maxi-ferritine forme une nanoparticule de 24 sous-unités avec un diamètre externe de ∼120Å.

Afin de développer une plate-forme largement accessible, nous avons fonctionnalisé l'échafaudage maxi-ferritine pour qu'il soit compatible avec les composants de la technologie tétramère existante qui utilise des monomères pMHC biotinylés et des conjugués SAv. Nous avons inséré une séquence signal de biotinylation (26) à l'extrémité N de chaque sous-unité de maxi-ferritine ( monomer23kDa monomère) et utilisé SAv comme une «colle moléculaire» pour réunir les monomères pMHC et l'échafaudage (Fig. 1A-C).

Nous avons optimisé les attaches pour SAv sur l'échafaudage maxi-ferritine en testant un ensemble de lieurs qui couvraient une large gamme de longueurs et de rigidités moléculaires (Illustration S2A-B) (27). Comme indiqué, l'échafaudage optimisé avec des attaches à projection radiale pourrait être purifié facilement et fonctionnalisé avec de la biotine (1D). Nous avons ensuite lié l'échafaudage biotinylé au SAv conjugué à deux molécules de peptide-MHC (SAv-pMHC2 : SAv semi-saturé) (Fig.

1E-F). La formation du précurseur SAv-pMHC2 n'est pas significativement impactée par différents fluorophores conjugués à SAv, même si PE et PE/Cyanine7 par exemple sont des molécules beaucoup plus grosses que Alexa 488, eFluor 450 et Alexa 647 (Illustration S3A). Le SAv semi-saturé a deux sites de liaison à la biotine disponibles pour lier l'échafaudage.

Après saturation, nous avons observé l'affichage de 12 molécules pMHC tel que déterminé par chromatographie d'exclusion stérique (SEC) et Blue native PAGE (BN-PAGE) (Illustration S4A-B). L'itération actuelle ne permet pas la conjugaison d'un plus grand nombre de molécules de pMHC, vraisemblablement à cause d'un encombrement stérique. Il est également possible que deux lieurs biotinylés adjacents sur l'échafaudage soient occupés par une seule molécule SAv-pMHC2.

Nous avons ensuite purifié le sphéromère homogène par chromatographie d'exclusion stérique pour exclure la contribution de tout SAv-pMHC2 n'ayant pas réagi. (1G). Nous avons également validé la conjugaison de SAv-pMHC2 sur l'échafaudage fonctionnalisé de maxi-ferritine à l'aide d'un EM à coloration négative.

(1H) et ELISA (Fig. 1I-J). Un autre objectif au cours de la phase de conception extensive du linker (L1-L19) était d'optimiser la projection radiale des attaches de biotine à partir de l'échafaudage de maxi-ferritine pour identifier une construction (L6 : (SG2P) 2SG2) la moins impactée par différents fluorophores.

Comme indiqué, tous les sphéromères assemblés à l'aide de l'échafaudage optimisé de maxi-ferritine (affichant le lieur L6) et cinq SAv conjugués à des fluorophores différents ont formé un complexe homogène en solution (Fig. S3B-E).

Fig.

1 Assemblage et caractérisation du « sphéromère ». (UNE) Représentation de surface moléculaire de pMHC (PDB ID : 3TO2, chaîne α en bleu clair, β2m en bleu foncé et peptide en jaune) et SAv (PDB ID : 2RTG, monomère en rouge et reste dans le corail). (B) Modèle d'un intermédiaire SAv-pMHC2 semi-saturé qui possède deux sites de liaison à la biotine inoccupés.

Une seule orientation est indiquée pour plus de simplicité. (C) Un modèle de sphéromère assemblé par conjugaison de six molécules de SAv-pMHC2 semi-saturées sur un échafaudage de maxi-ferritine fonctionnalisé (PDB ID:2JD6, gris). UCSF Chimera a été utilisé pour les graphiques moléculaires.

(RÉ) Test de gel-shift à la streptavidine pour évaluer la fonctionnalisation de la maxi-ferritine. Piste 1 : échafaudage de maxi-ferritine biotinylée. La protéine se dissocie en monomères (23,4 kDa) après ébullition et migre à la taille correspondante sur un gel dénaturant.

Piste 2 : L'attache flexible conçue à l'extrémité N de chaque monomère possède un site de liaison à la biotine. Lors de l'incubation avec le SAv, la migration des monomères de maxi-ferritine biotinylés est retardée en raison de la formation d'un complexe. (E) La formation de SAv-pMHC2 semi-saturée surveillée par test de décalage sur gel de streptavidine.

La chaîne du CMH est biotinylée et se déplace lors de la liaison de SAv. Le pMHC a été incubé avec des concentrations limites de SAv entraînant la formation d'oligomères avec une augmentation progressive de la valence. SDS-PAGE est montré pour le titrage d'une molécule MHC-II avec SAv.

(F) Quantification de la formation de SAv-pMHC2 en fonction des concentrations de pMHC et de réactifs SAv. La moyenne ± SD des mesures de trois expériences est montrée. (G) Chromatogramme d'exclusion stérique du sphéromère et de ses composants.

(H) Micrographies électroniques représentatives de maxi-ferritine et de sphéromère colorés négativement. Les SAv-pMHC2 conjugués à la surface de l'échafaudage fonctionnalisé sont indiqués par des flèches rouges. Barres d'échelle, 20 nm.

Validation de la conjugaison SAv-pMHC2 au sphéromère en utilisant (JE) anti-CMH (J) anticorps anti-streptavidine par ELISA (moyenne ± ET). L'expérience a été réalisée avec chaque échantillon en triple et répétée au moins deux fois.

Nous avons caractérisé l'applicabilité générale du sphéromère à l'aide d'un ensemble de paires TCR-pMHC avec une utilisation TRBV distincte, des sources d'antigène et des exemples représentant à la fois les molécules MHC-I et MHC-II.

(Figure 2A). La liaison du TCR avec différentes formulations de leur pMHC apparenté (monomère, tétramère et sphéromère) a été déterminée par interférométrie en biocouche (Figues. 2B-C et S5A-B).

Fait encourageant, le sphéromère liait tous les TCR évalués significativement mieux que les autres formulations (monomère et tétramère). En moyenne, pour la restriction MHC-I, le sphéromère liait les TCR avec une affinité nette > 250 (monomère) et > 50 fois (tétramère) supérieure. Pour les TCR restreints au CMH-II, le sphéromère s'est lié avec une affinité nette > 200 (monomère) et > 20 fois (tétramère) supérieure à travers les paires testées.

Nous avons également généré des lignées de cellules T stables pour comparer la liaison de différentes formulations de pMHC (tétramère, dextramère et sphéromère) en utilisant la cytométrie en flux (Figues. 3A-F et S6A-F). Comme indiqué, pour toutes les paires pMHC-TCR évaluées, en accord avec l'avidité accrue, le signal de la coloration des sphéromères était significativement meilleur (∼ 10 fois) que le tétramère.

Nous avons inclus des contrôles négatifs (cellules TCR−/− Jurkat et une lignée cellulaire exprimant un TCR non pertinent) pour déterminer la coloration de fond, car une valence plus élevée peut entraîner une amplification du bruit en raison d'interactions non spécifiques (19, 20). Nous avons observé que même s'il y avait une augmentation de l'intensité de la coloration avec la coloration du dextramère (∼ 6 fois) par rapport au tétramère, la coloration de fond était également plus élevée. En revanche, la coloration de fond avec le sphéromère n'a pas augmenté de manière substantielle, résultant en un meilleur rapport signal/bruit par rapport aux autres formulations de pMHC (Figues.

3C, F et S6C, F). Cette différence est probablement due au fait que le sphéromère est une structure discrète et homogène par rapport à un mélange de polymères de dextrane dans les réactifs de dextramère. Le sphéromère se colore mieux que le tétramère quel que soit le fluorophore conjugué (Illustration S7A-B).

Un échafaudage de maxi-ferritine conjugué à un fluorophore peut également être utilisé pour assembler le sphéromère avec SAv-pMHC2 non marqué (Illustration S7C).

2 Le sphéromère se lie à la fois aux TCR restreints au MHC-I et au MHC-II avec une avidité élevée. (UNE) Liste des paires pMHC-TCR évaluées.

La reliure de (B) TCR1 et (C) Le TCR3 à différentes formulations de BHW58-A*02:01 et de protéine III-DRB1*15:01 respectivement a été déterminé par interférométrie en biocouche. Une superposition de traces de liaison sur une série de concentrations de la formulation pMHC indiquée d'une expérience représentative est montrée. Chaque expérience de liaison a été répétée au moins trois fois.

La moyenne ± SD de la constante de liaison a été représentée graphiquement.

3 Le sphéromère se lie aux lignées cellulaires T exprimant des TCR restreints au MHC-I ou au MHC-II avec une spécificité élevée. (UNE) Diagrammes de cytométrie en flux représentatifs montrant la liaison des formulations BHW58-A*02:01 indiquées avec une concentration de pMHC équivalente à une lignée cellulaire T exprimant TCR1.

La liaison non spécifique des différentes formulations a été mesurée en utilisant des cellules Jurkat non transduites et une lignée cellulaire exprimant un TCR non pertinent. CD3 a été mesuré comme proxy pour l'expression du TCR. (B) Quantification de la liaison BHW58-A*02:01 mesurée par cytométrie en flux (moyenne ± SD).

L'expérience a été réalisée avec chaque échantillon traité en double et répété au moins deux fois. (C) Le rapport signal/bruit (S/N) de la liaison de TCR1 à des formulations multivalentes distinctes de BHW58-A*02:01. La moyenne ± SD des mesures de deux expériences indépendantes a été tracée.

(RÉ) Diagrammes de cytométrie en flux représentatifs montrant la liaison des formulations de protéine III-DRB1*15:01 indiquées avec une concentration de pMHC équivalente à une lignée de cellules T exprimant TCR3. La liaison non spécifique aux cellules Jurkat et un TCR non pertinent ont également été mesurés. CD3 a été mesuré comme proxy pour l'expression du TCR.

(E) Quantification de la liaison à la protéine III-DRB1*15:01 (moyenne ± SD) mesurée par cytométrie en flux. (F) Le rapport signal/bruit (S/N) de la liaison du TCR3 à des formulations multivalentes distinctes de la protéine III-DRB1*15:01 (moyenne ± SD).

Ensuite, nous avons évalué les cellules T CD8+ spécifiques du virus chez des individus sains pour répondre aux questions suivantes : i) Le sphéromère détecte-t-il une fréquence plus élevée de cellules T spécifiques de l'antigène que le tétramère ex vivo ? ii) Comment se comparent les répertoires de TCR détectés par le sphéromère et le tétramère ? Nous avons utilisé des épitopes restreints immunodominants HLA-A * 02:01 (influenza-M1 et HCMV-pp65) pour caractériser le sphéromère car il existe des données considérables disponibles pour l'analyse comparative (28).

Les cellules T CD8+ isolées de chaque donneur (n = 7) ont été divisées uniformément pour la coloration des tétramères ou des sphéromères (Figues. 4A-B et S8A-C). Les fréquences des cellules T spécifiques de l'antigène détectées à l'aide du tétramère sont cohérentes avec les études précédentes (29-32).

Comme indiqué, une fréquence significativement plus élevée de cellules T CD8+ spécifiques de l'antigène a pu être détectée pour les spécificités virales M1 (p = 0,015) et pp65 (p = 0,016). (Figues. 4C-D et S8D).

Comme prévu, la fréquence des cellules T CD8+ spécifiques de l'antigène chez les donneurs HCMV-négatifs était significativement inférieure à celle des donneurs HCMV-positifs (Illustration S8E). Nous avons également validé la coloration des sphéromères à l'aide de monomères pMHC A*02:01 biotinylés achetés auprès de l'installation principale de tétramères du NIH, qui est une source majeure de réactifs tétramères pour la communauté de recherche dans le monde entier. (Illustration S9A-D).

Ensuite, nous avons trié les cellules sphéromères + CD8 + T sur une seule cellule et effectué un séquençage -TCR apparié pour étudier le répertoire (33). Les séquences de TCR dérivées de sphéromères ont été analysées par rapport aux entrées de TCR dans VDJdb, une base de données organisée de TCR avec des spécificités d'antigène connues (28). Nous avons comparé l'utilisation de TRBV des séquences TCR obtenues à l'aide de formulations pMHC distinctes (Fig.

4E, G). Dans l'ensemble, nous avons observé que le sphéromère détectait un répertoire beaucoup plus diversifié par rapport au tétramère ou au dextramère. Comme indiqué, les séquences de TCR spécifiques à M1 détectées avec le sphéromère avaient une utilisation significativement plus élevée (valeur de p < 0,01, test de Fisher) de 5 et 3 gènes TRBV par rapport aux séquences dérivées de tétramères et de dextramères, respectivement, avec 2 chevauchement des gènes (TRBV12-3 et TRBV28) à travers eux (4E).

De même, les séquences TCR sphéromère+ pp65 ont montré un enrichissement de 4 gènes TRBV par rapport au tétramère et 1 gène TRBV avec le dextramère (Figure 4G). Curieusement, TRBV6-5 est significativement enrichi en séquences TCR tétramère + pp65 + par rapport aux séquences dérivées du dextramère et du sphéromère. Nous avons en outre analysé la spécificité des séquences de TCR dérivées de sphéromères à l'aide de GLIPH2 (grouping of lymphocyte interaction by paratope hotspots), un algorithme qui regroupe les TCR en fonction de la spécificité de l'antigène partagé.

(Fig. 4F, H) (34). Globalement, nous avons observé un chevauchement significatif (∼91 %) entre les « motifs » du TCR identifiés à l'aide des entrées de TCR spécifiques aux sphéromères et à l'antigène dans VDJdb.

La récupération de motifs TCR spécifiques à l'antigène précédemment caractérisés à l'aide du sphéromère fournit une confirmation supplémentaire que notre plate-forme conçue détecte effectivement les cellules T pertinentes. Le sphéromère pourrait détecter les TCR publics précédemment décrits pour les spécificités virales M1 (CDR3b : CASSIRSSYEQYF, CASSIRSAYEQYF) et pp65 (CDR3b : CASSYQTGASYGYTF) ayant une association significative avec HLA-A*02:01 (35, 36). Fait intéressant, le sphéromère a identifié un ensemble de motifs TCR qui ne se sont pas regroupés avec des séquences précédemment rapportées dans VDJdb (8 % pour M1 et 9 % pour pp65).

Afin de tester si ces TCR pouvaient conférer une réactivité aux pMHC avec lesquels ils ont été sélectionnés, nous avons généré des lignées de cellules T avec des TCR à partir de ces clusters GLIPH2 non identifiés auparavant. (Figues. 4I, K et S10A, C).

Comme le montre l'expression de CD69, ces lignées cellulaires T pourraient être activées spécifiquement à l'aide du peptide apparenté. (Figues. 4J, L et S10B, D).

Nous avons également mesuré la liaison du TCR de ces clones à leurs monomères pMHC apparentés par interférométrie en biocouche. Comme indiqué, les TCR détectés exclusivement à l'aide du sphéromère se liaient en moyenne au monomère pMHC avec une affinité ∼ 30 fois inférieure à celle des TCR de référence précédemment rapportés (37, 38) (Figues. 4M-N et S10E-F).

Ces résultats démontrent que les réactifs sphéromères ne sont pas seulement plus efficaces pour colorer les cellules T concernées, mais peuvent également identifier les cellules T spécifiques à l'antigène de faible affinité qui peuvent ne pas être détectées avec d'autres réactifs multimères.

Fig. 4 Spheromer détecte une fréquence plus élevée de cellules T spécifiques de l'antigène avec un répertoire de TCR plus diversifié.

Diagrammes représentatifs de cytométrie en flux de cellules T CD8+ isolées d'individus HLA-A*02:01 colorés avec influenza-M1 et HCMV-pp65 (UNE) tétramères ou (B) Sphéromères. Dénombrement des épitopes spécifiques (C) M1 et (RÉ) Cellules T pp65 CD8+ détectées chez des individus sains utilisant soit un tétramère, soit un sphéromère. Les données de chaque donneur (n=7) sont représentées par un point.

Un test bilatéral de Wilcoxon par paires appariées a été effectué pour déterminer les niveaux de signification. (E) Graphiques de volcan montrant la variance dans l'utilisation de TRBV des cellules T CD8+ spécifiques de M1-A*02:01 détectées à l'aide du sphéromère et d'autres multimères pMHC. Les gènes TRBV enrichis significativement (valeur p 0,01, test exact de Fisher) avec le sphéromère sont surlignés en violet.

(F) La distribution des motifs TCR spécifiques à la grippe-M1 dérivés de sphéromères identifiés par GLIPH2 et des exemples représentatifs de chaque catégorie. (G) Graphiques de volcan représentant la variance dans l'utilisation de TRBV des cellules T CD8+ spécifiques de pp65-A*02:01 détectées avec des multimères pMHC distincts. Les gènes TRBV enrichis significativement (valeur p 0,01, test exact de Fisher) avec le sphéromère sont mis en évidence en prune.

(H) La distribution des motifs TCR dérivés de sphéromères, spécifiques de HCMV-pp65 identifiés par GLIPH2 et des exemples représentatifs de chaque catégorie. (JE) Un cluster GLIPH2 représentatif avec une spécificité pour la grippe-M1 composé de séquences TCR identifiées exclusivement à l'aide du sphéromère. (J) Graphiques représentatifs de cytométrie en flux montrant l'activation d'une lignée cellulaire T (exprimant un TCR avec le motif « G%SG ») stimulée avec un peptide non pertinent ou apparenté (influenza-M1).

L'activation a été mesurée par l'expression de CD69. Le niveau de signification a été déterminé par un test t apparié bilatéral. (K) Un cluster GLIPH2 représentatif avec une spécificité pour HCMV-pp65 qui est composé exclusivement de séquences TCR dérivées de sphéromères.

(L) Graphiques représentatifs de cytométrie en flux montrant l'activation d'une lignée cellulaire T (exprimant un TCR avec le motif « G% LAGD ») stimulée avec un peptide non pertinent ou apparenté (HCMV-pp65). L'activation a été mesurée par l'expression de CD69. Un test t apparié bilatéral a été effectué pour déterminer la signification.

La liaison du TCR correspondant aux clones des clusters GLIPH2 composés exclusivement de séquences dérivées de sphéromères à leurs monomères pMHC apparentés (M) M1-A*02:01 et (N) pp65-A*02:01 déterminé par interférométrie de biocouche. Chaque expérience de liaison a été répétée au moins trois fois. La moyenne ± SD de la constante de liaison a été représentée graphiquement et comparée à un TCR spécifique de référence pour la grippe-M1 (JM22) et HCMV-pp65 (C25).

Pour répondre à la réponse immunitaire au SRAS-CoV-2, nous avons fabriqué des réactifs sphéromères pour évaluer les réponses des lymphocytes T CD8+ chez les individus non exposés et les patients COVID-19. Nous avons déjà montré que les cellules T à épitopes viraux peuvent être détectées dans le sang périphérique d'individus naïfs (39, 40). De manière significative, une grande fraction (~ 50 %) de ces cellules T chez les adultes (28-80 ans) présentait un phénotype mémoire, probablement en raison d'une réactivité croisée plus élevée du TCR ou d'expositions environnementales (39).

Le recrutement rapide de ces cellules T dans une réponse immunitaire pourrait offrir un avantage de survie, car l'expansion clonale et l'induction de lymphocytes mémoire sont un objectif clé des efforts de vaccination et sont fortement corrélées à la protection contre des maladies infectieuses particulières. Des études antérieures ont également montré que les fréquences des précurseurs des lymphocytes T sont en corrélation avec l'ampleur des réponses antivirales (41-43). Par conséquent, nous avons déterminé la fréquence des cellules T CD8+ par rapport à un panel d'épitopes du SRAS-CoV-2 (5A) chez des individus naïfs et non exposés utilisant le sphéromère.

Les peptides ont été sélectionnés parmi plusieurs cadres de lecture ouverts (ORF) du SRAS-CoV-2 couvrant les protéines ORF1ab, S, M et N (Tableau S1). Les peptides (9-mers) évalués dans cette étude ont été choisis en fonction de l'affinité de liaison prévue pour HLA-A * 02:01 déterminée à l'aide des recommandations de la base de données et de l'analyse des épitopes immunitaires (IEDB) (http://tools.iedb.

org /mhci/) (44) et contre-validé à l'aide des algorithmes SYFPEITHI (45). De plus, les propriétés biochimiques des acides aminés aux positions P2, P5 et P9 ont reçu des poids plus élevés (40, 46). Nous avons utilisé un test de stabilisation du CMH pour valider davantage la liaison des peptides aux molécules A*02:01 du CMH-I exprimées sur la lignée cellulaire T2 déficiente en traitement antigénique (TAP) (Illustration S11).

Nous avons également conçu notre panel de peptides pour représenter une gamme variée de similitudes de séquences avec des peptides de coronavirus humains communs causant le rhume (hCoV-OC43, HKU1, 229E, NL63) afin d'évaluer les réponses croisées. La matrice de substitution d'acides aminés pour déterminer la conservation de la séquence a été choisie sur la base d'études précédentes (47, 48) pour hiérarchiser les épitopes des cellules T du SRAS-CoV-2, mais il faut noter que des exceptions définies par un profil de réactivité croisée TCR idiosyncratique existeront. Nous avons utilisé une approche de coloration combinatoire telle que décrite précédemment pour sonder simultanément plusieurs spécificités dans un seul échantillon, suivie d'un enrichissement magnétique des cellules T CD8+ spécifiques de l'antigène.

(Illustration S12) (49). Chez les individus non exposés, nous avons observé que quelques épitopes du SRAS-CoV-2 (P5, P10, P12, P13, P17 et P18) avaient une fréquence de cellules CD8+ T élevée (2,07 × 10−4 ± 1,16 × 10−4) par rapport à d'autres peptides (2,96 × 10−5 ± 2,01 × 10−5) dans le panel (5B-C), bien qu'à des niveaux inférieurs à la fréquence des lymphocytes T contre les épitopes « immunodominants » d'autres virus (HCMV et grippe) (5C). Nous avons déterminé que la limite de détection après enrichissement magnétique était ∼2´10−7.

Nous avons validé expérimentalement la réactivité croisée entre un sous-ensemble d'épitopes du SRAS-CoV-2 et du hCoV saisonnier (Fig. 6A-B). Généralement, les épitopes auxquels nous avons observé des fréquences élevées de cellules T chez les individus non exposés étaient caractérisés par une similitude de séquence élevée avec les hCoV (Figure 6C).

Le séquençage TCR des cellules T CD8+ d'individus non exposés identifiés à l'aide de sphéromères présentant des épitopes du SRAS-CoV-2 a montré que les cellules T contre les peptides conservés dans les coronavirus sont relativement étendues par rapport aux cellules T contre les peptides uniques au SRAS-CoV-2 (Fig. 6D-E). La caractérisation phénotypique de ces cellules T spécifiques de l'antigène à l'aide des marqueurs CCR7 et CD45RA a montré une distribution distincte entre les compartiments naïf/mémoire pour les peptides testés (Fig.

7A-C). Les cellules T détectées avec des peptides ayant une faible similarité de séquence de hCoV ont démontré un phénotype principalement naïf. En revanche, les peptides contre lesquels des fréquences de cellules T relativement élevées ont été observées chez des individus non exposés ont montré un phénotype de mémoire (∼ 80%) et corrélés avec une similitude élevée de séquence de hCoV.

Cela suggère que l'exposition aux hCoV saisonniers parmi d'autres expositions environnementales à réaction croisée pourrait contribuer à l'expansion observée de ces cellules T. Ensuite, nous avons déterminé les fréquences des lymphocytes T CD8+ contre ces épitopes du SRAS-CoV-2 chez les patients COVID-19 présentant des symptômes légers ou sévères. Nous avons observé qu'en plus de la protéine de pointe (S : n = 4/6), les cellules T CD8+ contre les épitopes d'autres protéines SARS-CoV-2 (ORF1ab : n = 3/13, M : n = 2/4 et N : n = 1/2) étaient également présents à une fréquence significativement plus élevée chez les patients COVID-19 (léger/sévère) par rapport aux individus non exposés (Fig.

8A-D). Curieusement, nous avons observé que les fréquences des lymphocytes T CD8+ par rapport à des épitopes spécifiques étaient significativement différentes en comparant les patients COVID-19 légers et sévères. En général, les peptides qui ont montré une réponse plus élevée chez les patients sévères avaient une similitude plus faible avec les autres hCoV.

En revanche, les patients présentant des symptômes légers ont montré une réponse élevée aux peptides avec une similarité de séquence relativement plus élevée avec d'autres hCoV (Figure 8E). En utilisant GLIPH2, nous avons pu identifier des motifs TCR partagés entre des individus non exposés et des patients COVID-19 (Figure 8F). Les motifs TCR contre les épitopes conservés sont enrichis chez les patients COVID-19 présentant des symptômes légers.

En revanche, les motifs TCR caractérisant les patients COVID-19 sévères ont été détectés à l'aide de peptides principalement uniques au SRAS-CoV-2 (valeur de p ajustée = 0,00019, test de Fisher). Une fraction élevée de ces cellules T CD8+ spécifiques de l'antigène enrichies chez des patients atteints de COVID-19 léger a présenté un phénotype effecteur indiquant une activation récente de l'antigène (Fig. 8G-I).

Cela suggère que les cellules T trouvées chez les individus non exposés qui se lient aux épitopes du SRAS-CoV-2 pourraient être activement recrutées pendant l'infection. Dans l'ensemble, nos données suggèrent un recrutement préférentiel de cellules mémoire CD8+ T spécifiques aux épitopes conservés, qui sont probablement le résultat d'expositions antérieures au hCoV chez des patients COVID-19 développant des symptômes légers.

5 La fréquence des lymphocytes T CD8+ contre les épitopes du SRAS-CoV-2 conservés dans les hCoV saisonniers est élevée chez les individus non exposés.

(UNE) La conservation de la séquence des épitopes du SRAS-CoV-2 à travers les hCoV saisonniers. Les épitopes ont été sélectionnés sur la base de leurs propriétés biochimiques et de leur liaison à HLA-A*02:01. Ces peptides couvrent plusieurs régions codantes du SRAS-CoV-2 (ORF1ab, S, M et N) et présentent divers degrés de similarité de séquence.

Le score de conservation par paire entre le SARS-CoV-2 et tout hCoV donné est indiqué par la taille de la bulle. La couleur représente le score de conservation moyen sur tous les hCoV. (B) Diagrammes de cytométrie en flux représentatifs de la coloration combinatoire spécifique à l'antigène des PBMC d'un individu non exposé à l'aide de pools de sphéromères HLA-A * 02:01 après enrichissement magnétique.

Le code-barres du fluorophore comme indiqué dans les informations supplémentaires utilisées pour déterminer la spécificité de l'antigène est marqué en rouge à côté de la population fermée. (C) Le dénombrement des cellules T CD8+ spécifiques à l'épitope du SRAS-CoV-2 dans des échantillons de PBMC pré-pandémiques non exposés collectés entre avril 2018 et février 2019. Les données de chaque donneur (n = 5) sont représentées par un point.

La fréquence des cellules T spécifiques du SRAS-CoV-2 chez les individus non exposés est inférieure à celle des cellules T spécifiques du HCMV-pp65 et de la grippe-M1.

Figure 6 Réactivité croisée entre le SRAS-CoV-2 et les épitopes saisonniers des lymphocytes T hCoV CD8+. (UNE) Diagrammes de cytométrie en flux représentatifs montrant la co-coloration des cellules T CD8+ d'individus non exposés à l'aide de sphéromères affichant les peptides liés au SARS-CoV-2 et au hCoV A*02:01 indiqués après enrichissement magnétique.

Le score de conservation moyen sur tous les hCoV pour chaque épitope est répertorié. Pour la comparaison de séquences par paires : résidus identiques (rouge), résidus synonymes définis dans notre matrice de substitution (bleu), reste (noir). (B) Corrélation entre la fraction de cellules T CD8+ co-colorées et la similarité de séquence moyenne des épitopes du SRAS-CoV-2 avec les hCoV chez des individus sains et non exposés (n = 3).

(C) Une corrélation positive a été observée entre la similarité de séquence moyenne des épitopes du SRAS-CoV-2 avec les hCoV et la fréquence de base des cellules T CD8+ spécifiques à l'épitope du SRAS-CoV-2 chez des individus sains et non exposés. (RÉ) Évaluation de l'expansion clonale chez des individus non exposés à l'aide du séquençage TCR monocellulaire de cellules T CD8+ spécifiques du SRAS-CoV-2 identifiées à l'aide d'un sphéromère. Un graphique récapitulatif de la clonalité du TCR sur tous les épitopes du SRAS-CoV-2 testés dans cette étude.

Les données ont été divisées en 2 groupes (uniques ou conservés) sur la base d'un seuil 75 % (permettant 2 mésappariements dans un 9-mère donné). Chaque point individuel représente un clone de TCR distinct. (E) Corrélation entre la similarité de séquence moyenne des épitopes du SRAS-CoV-2 avec les hCoV et la taille du plus grand clone de TCR de la spécificité correspondante.

7 Les cellules T CD8+ chez les individus non exposés contre les épitopes conservés du SRAS-CoV-2 présentent un phénotype de mémoire prédominant. (UNE) Graphiques représentatifs de cytométrie en flux montrant la distribution des cellules T CD8+ spécifiques du SRAS-CoV-2 dans les sous-ensembles naïfs et mémoire définis sur la base de l'expression des marqueurs CD45RA et CCR7 ; naïf (CD45RA+CCR7+), mémoire centrale (CM, CD45RA-CCR7+), mémoire effectrice (EM, CD45RA-CCR7-) et mémoire effectrice exprimant CD45RA (TEMRA, CD45RA+CCR7-) chez des individus sains et non exposés. Les cellules T CD8+ spécifiques de l'antigène ont été enrichies à l'aide de billes magnétiques.

(B) Quantification des cellules T CD8+ spécifiques au SRAS-CoV-2 dans les sous-ensembles naïfs et mémoriels chez des individus sains et non exposés. (C) Corrélation entre la similarité de séquence moyenne des épitopes du SRAS-CoV-2 à travers les hCoV et la fréquence des cellules T CD8+ à mémoire (non naïves).

Fig.

8 Les patients COVID-19 avec des résultats cliniques divergents présentent des réponses distinctes des lymphocytes T CD8+ spécifiques à l'épitope du SRAS-CoV-2.La fréquence des cellules T CD8+ spécifiques à l'épitope du SRAS-CoV-2 chez les individus non exposés et les patients COVID-19 atteints d'infections légères (n=13) et sévères (n=11) : (UNE) ORF1ab, (B) S, (C) M et (RÉ) N. La valeur p ajustée telle que déterminée par le test de Dunn corrigée pour les comparaisons multiples est rapportée pour les spécificités avec une différence significative entre les patients COVID-19 légers et sévères.

(E) Corrélation entre la similarité de séquence moyenne des épitopes du SRAS-CoV-2 à travers les hCoV et la fréquence des cellules T CD8+ spécifiques de l'antigène chez les patients COVID-19. (F) La distribution des motifs TCR spécifiques au SRAS-CoV-2 partagés entre les individus non exposés et les patients COVID-19. Les motifs TCR ont été identifiés à l'aide de GLIPH2.

Un score OMS inférieur indique des symptômes plus légers. Les motifs TCR partagés entre les individus non exposés et les patients COVID-19 légers ont été identifiés par des épitopes conservés du SRAS-CoV-2. En revanche, des motifs TCR caractérisant des patients COVID-19 sévères ont été détectés chez des individus non exposés à l'aide de peptides principalement uniques au SRAS-CoV-2 (valeur p ajustée = 0,00019, test de Fisher).

(G) Representative flow cytometry plots showing the distribution of SARS-CoV-2 specific CD8+ T cells across the naïve and memory subsets in COVID-19 patients. The antigen-specific CD8+ T cells were enriched using magnetic beads. Quantification of SARS-CoV-2 specific CD8+ T cells across the naïve and memory subsets in (H) mild and (I) severe COVID-19 patients.

DISCUSSION

Antigen-specific T cell responses are known to be essential for an effective immune response against many infectious diseases but defining specific benchmarks for what is protective versus what is not has been challenging, especially in human studies (50, 51). This is due to many factors, including the low frequency of disease-relevant T cells, particularly when clinical samples are limiting, as they typically are. Consequently, some methods used to investigate T cells necessitate expansion of cells in culture which may alter the relative abundance and phenotype of some T cell clonotypes.

Also, the TCR repertoire cannot be studied with some of these methods due to their incompatibility with sequencing techniques. The development of tetramer technology partially addressed this limitation and enabled the direct measurement and characterization of T cells ex vivo. Subsequent advances, both in terms of reagents and methods, have widened the scope of applications (17–19, 49, 52–56).

However, the detection of low-affinity T cells is still lacking in many cases (18).
Here, we report the development of a multivalent ‘spheromer’ system built on the scaffold of a self-assembling maxi-ferritin nanoparticle. As shown, the system has been engineered to be compatible with current pMHC (both MHC-I and MHC-II molecules) and SAv reagents that allows ease-of-use.

The optimized spheromer assembly pipeline resulted in a very consistent reagent across multiple batches of synthesis with a relative ease of production, unlike the dodecamer (19). The defined geometry of the scaffold facilitated precise site-directed conjugation of pMHC, leading to a relatively homogenous reagent as assessed using a size-exclusion column. The spheromer bound cognate TCRs with a significantly higher avidity when compared to the tetramer, for both MHC-I (>50-fold) and MHC-II (>20-fold) molecules.

Also, the low background contributed to the better signal-to-noise ratio observed in comparison to other pMHC-formulations tested. The improved TCR-binding properties of the spheromer may also be in part due to better 2D binding kinetics owing to its larger diameter. This may provide a better surrogate than either the tetramer or dextramer for membrane-embedded pMHC molecules that engage TCRs in vivo.

This increased avidity and specificity can potentially enable the detection of more disease relevant, low-affinity T cells. Using the HLA-A*02:01-restricted influenza-M1 and HCMV-pp65 epitopes, we demonstrated that a significantly higher frequency of antigen-specific CD8+ T cells with a much more diverse TCR repertoire could indeed be detected with the spheromer. These results demonstrate that our engineered scaffold can be readily adapted with currently available reagents without a time-consuming systemic overhaul.

We further applied the spheromer technology to delineate the CD8+ T cell response to SARS-CoV-2 using a panel of peptides derived from multiple proteins (ORF1ab, S, M and N) that were validated for HLA-A*02:01 binding. Studies have shown that a T cell response can indeed be generated against multiple SARS-CoV-2 proteins (7–13). We observed a relatively higher frequency of T cells against a few epitopes in the ORF1ab (P5, P10, P12, and P13) and S (P17 and P18) proteins in naïve, unexposed individuals.

The high sequence similarity of these epitopes to hCoVs and the predominant memory phenotype of these T cells suggests that exposure to seasonal coronaviruses could contribute to the expansion of potentially cross-reactive T cells. Importantly, the frequency of T cells against a subset of these cross-reactive peptides (P5, P10, P12 and P17) was significantly higher in COVID-19 patients with mild symptoms. In contrast, T cells to unique ORF1ab derived peptides (P1 and P8) were higher in severely ill COVID-19 patients.

These peptides (P1 and P8) have low sequence similarity to hCoVs. Overall, our data indicate that mild and severe COVID-19 patients elicit distinct T cell responses to particular SARS-CoV-2 epitopes. Also, the preferential recruitment of memory CD8+ T cells to cross-reactive epitopes likely contributes to their mild symptoms.

These cross-reactive T cell responses need to be investigated in children as they may contribute to their milder clinical symptoms when compared to adults (57) since seasonal hCoVs infections are more frequent in children than adults (58). This study suggests that in addition to pre-existing cross-reactive memory CD4+ T cells reported previously (10), dissimilar SARS-CoV-2 epitope-specific CD8+ T cell responses could also contribute to divergent COVID-19 clinical outcomes. The observation of CD8+ T cell responses to multiple SARS-CoV-2 proteins is consistent with previous studies.

Accordingly, the data presented here suggests that the incorporation of additional non-spike epitopes into a vaccine could further bolster anti-viral T cell immunity. This can be important given the emergence of several SARS-CoV-2 variants of concern (https://www.cdc.

gov/coronavirus/2019-ncov/cases-updates/variant-surveillance/variant-info.html). Sequence analysis of SARS-CoV-2 epitopes found to be associated with mild symptoms in our study across variants indicates that one of the two spike protein epitopes (P17: VLNDILSRL) has mutated (S®A) in the B.

1.1.7 lineage variants circulating in Europe.

In contrast, none of the non-spike protein epitopes associated with mild symptoms were mutated across the analyzed variants (59, 60).
Overall, this study demonstrates the potential of the spheromer technology but is limited in terms of the specificities and samples used for comparing the different pMHC-multimer platforms. Extending these results to other class I and class II HLA alleles will be important in the future, but the results shown here are consistent across different antigens complexed to HLA-A*02:01 and in our experience it would be surprising if it wasn’t advantageous to use this platform for other HLA alleles as well.

MATERIALS AND METHODS

Study design

The objective of this study was to measure cross-reactive CD8+ T cell immunity between seasonal coronaviruses that cause the common cold and SARS-CoV-2. We measured the frequency of antigen-specific T cells in unexposed pre-pandemic donors and COVID-19 patients presenting mild or severe symptoms to evaluate the contribution of pre-existing immunity to seasonal coronaviruses in disease resolution. For direct, ex vivo detection of antigen-specific T cells at single epitope resolution, we developed an improved multimeric αβ T cell staining “spheromer” reagent.

Design, expression and characterization of multimeric protein scaffolds

In order to develop an optimized self-assembling protein scaffold for the multivalent presentation of peptide-MHC (pMHC) molecules, we designed and tested several (n > 30) protein constructs. All constructs were codon-optimized for expression in mammalian cells. Gene blocks (Integrated DNA Technologies) corresponding to individual constructs were cloned into a vector with a CMV/R promoter by Gibson assembly (New England Biolabs) and sequence confirmed (Elim Biopharm).

We first evaluated the heterologous recombinant expression of self-assembling proteins with different oligomeric states (n = 12, 24 and 60). The sequences corresponding to mini-ferritin (12-mer, UniProt accession ID: P0ABT2), maxi-ferritin (24-mer, UniProt accession ID: Q8U2T8) and lumazine synthase (60-mer, UniProt accession ID: E6PLJ8) were cloned and expressed in Expi293F cells (Thermo Fisher Scientific) as per the manufacturer recommendations. Briefly, 100ml of Expi293F cells sub-cultured at a density of 3×106 viable cells/ml in Expi293 expression media (Thermo Fisher Scientific) were transfected with the expression plasmids complexed with ExpiFectamine 293 transfection reagent.

Next day (∼18-22h post-transfection), the cells were supplemented with a cocktail of enhancers. The cell cultures were further incubated for 4 days. Subsequently, the culture supernatants were harvested by centrifugation (2000×g, 30 min, 4°C) for protein purification.

The supernatants were filtered (0.45mm PES membrane filters, Thermo Fisher Scientific) and diluted with 20 mM Tris-HCl, pH 8. The proteins were bound to a HiTrap Q FF anion exchange column (Cytiva) using an AKTA pure 25 L1 system (Cytiva).

An NaCl gradient (in 20 mM Tris-HCl, pH 8) was used to elute the bound proteins. The yield and purity of the multimeric protein scaffolds was estimated using a NuPAGE Bis-Tris 4-12% gradient gel system (Thermo Fisher Scientific). The homogeneity of the purified proteins was assessed using size-exclusion columns (Superdex 200 Increase 10/300 GL, Superose 6 Increase 10/300 GL (Cytiva)) that were calibrated using a wide range of molecular weight standards (Bio-Rad).

On the basis of protein yield and homogeneity, we further optimized the maxi-ferritin scaffold for pMHC display by testing multiple linkers varying in length and rigidity. A list of all the evaluated linkers is given in Fig. S2A.

Each construct was expressed in mammalian cells and purified as described above. The protein construct with linker (SG2P)2SG2 (L6) was chosen for “spheromer” assembly based on yield and optimal radial projection from the scaffold. The sequence of the optimized maxi-ferritin scaffold is given in Fig.

S2B. Site-directed functionalization (biotinylation) of the scaffold was performed using BirA biotin-protein ligase. The purified scaffold was incubated with components of the biotinylation reaction as per the manufacturer’s recommendation (Avidity).

The functionalized scaffold was subsequently separated from free biotin using a Superdex 200 Increase 10/300 GL (Cytiva) size-exclusion column. Next, the efficiency of protein biotinylation was assessed using a streptavidin gel-shift assay. Briefly, the protein was boiled at 90°C for 7 min before incubation on ice for 10 min.

Subsequently, a 2-fold molar excess of streptavidin (SAv, Agilent) was added to the protein and incubated further for an additional 10 min on ice. The shift in mobility of the scaffold resulting from SAv binding was evaluated using the NuPAGE Bis-Tris 4-12% gradient gel system (Thermo Fisher Scientific).

Spheromer assembly and characterization

The spheromer assembly is a two-step process: i) Generation of a semi-saturated SAv-pMHC2 complex, and ii) Conjugation of SAv-pMHC2 to the functionalized maxi-ferritin scaffold.

We optimized the reaction conditions for getting the maximum yield of SAv-pMHC2 by varying the reactant concentrations, incubation time, agitation conditions and reaction temperature. We evaluated the formation of SAv-pMHC2 by size-exclusion chromatography (Cytiva) and NuPAGE Bis-Tris 4-12% gradient gel system (Thermo Fisher Scientific). The maximum yield of SAv-pMHC2 was obtained by incubating 1 μM of the pMHC (monomer) with 0.

45 μM of SAv at 25°C for 30 min without agitation. Subsequently, the spheromer complex was assembled by incubating SAv-pMHC2 with the functionalized scaffold for 1h at room temperature with mild rotation. The unconjugated and fluorophore-conjugated SAv were sourced from Agilent and Invitrogen, respectively.

We determined the stoichiometry of pMHC saturation on the spheromer by incubating the functionalized scaffold with increasing concentrations of SAv-pMHC2 and analyzing the resulting product on size-exclusion columns calibrated using a broad range of molecular weight standards. The complexes were also assessed by Blue native PAGE (BN-PAGE) as per the manufacturer recommendations (Thermo Fisher Scientific). We further purified the spheromer assembly using a size-exclusion column to mitigate the confounding effects from any unreacted SAv-pMHC2.

We also validated the conjugation of pMHC onto the functionalized scaffold by negative stain electron microscopy. 5μl of the purified samples (0.005-0.

5 mg/ml) was applied on glow discharged carbon-coated grids, blotted and stained with 1% uranyl formate according to standard protocols (61). Negative stained grids were imaged on an FEI Morgagni at 100kV.
The number of pMHC molecules conjugated to the engineered maxi-ferritin scaffold was also quantified by ELISA using standard curves generated for pMHC and SAv.

Briefly, test samples were coated on 96-well Nunc plates (Thermo Fisher Scientific) at 2 mg/ml in 50 μl PBS, pH 7.4 at 37°C for 1 hour. Plates were then washed with PBS containing 0.

05% Tween-20 (PBST) and blocked with 3% skim milk in PBST for 1h. The plates were washed and incubated at room temperature with 50 μl of HRP-conjugated anti-streptavidin IgG (Abcam) in blocking buffer at a predetermined dilution (1:5000) for 1h for the detection of SAv. Alternatively, MHC-I and MHC-II molecules were detected using HRP-conjugated anti-human HLA-A2 antibody (LSBio) or HRP-conjugated anti-human HLA-DR antibody (LSBio).

Plates were washed with PBST and developed with 75 μl/well of the substrate 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) solution (MilliporeSigma). The reaction was stopped with 100 μl/well of ELISA stop solution for TMB (Thermo Fisher Scientific). The optical density at 450 nm was measured using the FlexStation 3 Multi-Mode Microplate Reader (Molecular Devices) and corrected for any non-specific background signal from ovalbumin coated wells.

Cloning, expression and purification of soluble TCRs

The soluble TCRs were expressed and purified as described previously (62). Briefly, for each TCR, the extracellular domains corresponding to the TCRα and TCRβ chains were codon-optimized for expression in insect cells and cloned independently into a baculovirus expression vector optimized for TCR expression by Gibson assembly (New England Biolabs). The sequence confirmed (Elim Biopharm) plasmids were amplified in E.

coli (New England Biolabs). Each plasmid was co-transfected with BestBac Linearized Baculovirus DNA (Expression Systems) into Sf9 insect cells (Expression Systems) using Cellfectin II for the production of baculoviruses. The P1 stocks of TCRα and TCRβ baculoviruses of a given TCRαβ pair were titrated to ensure a 1:1 TCRαβ hetero-dimer formation and then co-transduced into High Five cells (Thermo Fisher Scientific).

After 3 days, the supernatant was collected by centrifugation. A precipitation mix (50 mM Tris-HCl (pH 8), 1 mM NiCl2, and 5 mM CaCl2) was added to the supernatant while stirring for 15 min at 25°C. The precipitation was subsequently removed by centrifugation and the supernatant was incubated with buffer-equilibrated Ni-NTA beads (Qiagen) for 4h at 25°C under mild mixing conditions.

Then, the Ni-NTA beads were collected and washed with 20 mM imidazole in HBS (pH 7.2). The bound protein was eluted using 200 mM imidazole in HBS (pH 7.

2). The TCRαβ heterodimer was further purified by a size-exclusion column (Superdex 200 Increase 10/300 GL (Cytiva)) using an AKTA pure 25 L1 system (Cytiva) equilibrated with HBS (pH 7.2).

The eluted fractions were analyzed for purity using SDS-PAGE and subsequently pooled.

MHC-I protein purification and peptide exchange

In order to generate HLA-A*02:01 (MHC-I) monomers, the corresponding α-chain and β2m protein constructs were overexpressed separately in E.coli.

The protein was refolded from the inclusion bodies in the presence of a UV-cleavable peptide and biotinylated for downstream applications as described previously (63). After purification, the protein was concentrated and stored with 20% glycerol at −80°C. For each epitope specificity tested in this study, peptide exchange reactions were set up in a volume of 100 μl containing 0.

2 mM peptide and 100 μg/ml HLA-A*02:01 protein in PBS (pH 7.4). The reaction mixture was exposed to 365nm UV-light irradiation for 20 min using a Stratagene UV Stratalinker 2400 in 96-well U-shaped-bottom microplates (Corning).

The plate was then transferred to 4°C overnight to complete the exchange. The protein was subsequently buffer exchanged against PBS (pH 7.4) using Microcon centrifugal filters (10 kDa cut-off, MilliporeSigma) to remove the excess free peptide and subsequently spun at 13000×g for 15 min at 4°C to remove aggregates.

The protein was filtered and stored at 4°C until further use.

Purification of MHC-II heterodimers and peptide exchange

The ectodomains of HLA-DRA, HLA-DRB1*04:01 and HLA-DRB1*15:01 were cloned into a CMV/R promoter-based vector by Gibson assembly (New England Biolabs). The gene constructs were codon-optimized for mammalian expression.

The sequence confirmed (Elim Biopharm) plasmids were amplified in E.coli. Plasmids encoding the MHCα and MHCβ-chains of a given MHCαβ hetero-dimer were co-transfected into Expi293F cells (Thermo Fisher Scientific) following the manufacturer recommendations.

The transfected cells were enhanced ∼18-20h post-transfection with the ExpiFectamine 293 transfection enhancers 1 and 2 (Thermo Fisher Scientific). The supernatant was harvested 5 days post-transfection and incubated with buffer-equilibrated Ni-NTA beads (Qiagen) for 5h at 4°C. The Ni-NTA beads were then collected, washed (20 mM imidazole in HBS (pH 7.

2)) and the bound protein was eluted under gravity flow with 200 mM imidazole in HBS (pH 7.2). The protein was buffer-exchanged to remove the imidazole and biotinylated using the BirA biotin-protein ligase reaction kit (Avidity) as per the manufacturer recommendations.

The MHC-II heterodimer was subsequently purified by via size-exclusion chromatography (Superdex 200 Increase 10/300 GL (Cytiva)) using an AKTA pure 25 L1 system (Cytiva) equilibrated with HBS (pH 7.2). The eluted fractions were analyzed for purity and pooled, and also assessed for biotinylation efficiency using SDS-PAGE.

Thrombin (Novagen) was used to cleave the invariant CLIP peptide from the purified MHC-II molecules to enable exchange with the test peptide. After 2h incubation of MHC-II molecules with thrombin at room temperature, the reaction was stopped by the addition of a protease inhibitor cocktail (MilliporeSigma). The cleaved MHC-II protein was incubated at 30°C overnight in an aqueous solution of 1% octyl β-D-glucopyranoside, 0.

1 M NaCl, 50 mM citrate (pH 5.2), 1 mM EDTA, and 0.4 mg/mL test peptide for completion of exchange.

Next day, the reaction was neutralized with 1M Tris-HCl (pH 8). The excess peptide was removed during buffer exchange against PBS (pH 7.4) using Microcon centrifugal filters (10 kDa cut-off, MilliporeSigma).

The protein was further spun at 13000×g for 15 min at 4°C to remove aggregates and filtered before storing at 4°C until further use.

Generation of pMHC multimer reagents

Here, we generated different multivalent formulations of a given pMHC specificity to enable comparative analysis. In order to ascribe the observed differences to the multimerization scaffold, all the multivalent pMHC formulations (tetramer, dextramer and spheromer) were made using the same stock of purified MHC molecules.

The pMHC-tetramers were generated as described previously (63). Briefly, fluorophore-conjugated streptavidin (Invitrogen) was added to each pMHC monomer incrementally to achieve a 4:1 (pMHC:SAv) molar ratio. Next, streptavidin agarose was added to each tetramer for quenching any unbound, biotinylated pMHC.

After filtration, biotinylated agarose beads were added to remove any unsaturated streptavidin molecules. The protein was filtered and stored at 4°C until further use. We also used a previously described protocol for generating the pMHC-dextramers (19).

The biotinylated pMHC molecules were incubated with fluorophore-conjugated streptavidin (Invitrogen) at a molar ratio of ∼3.5:1 (pMHC:SAv) for 30 min at room temperature. To this mixture, biotin-dextran (MW = 70 kDa, Thermo Fisher Scientific) was added at a molar ratio of ∼30:1 (pMHC:Dextran) and incubated further for another 30 min at room temperature.

The spheromer assembly has already been described above.

Binding affinity measurements using biolayer interferometry (BLI)

Binding affinity for the cognate TCR-pMHC pairs was determined by BLI using an Octet QK instrument (ForteBio). The purified, soluble TCRs were captured onto amine reactive second-generation (AR2G) biosensors using the amine reactive second-generation reagent kit.

The ligand-bound biosensors were then dipped into a decreasing concentration series (50 μM followed by 2-fold dilutions) of the indicated analytes in PBST (PBS with 0.05% Tween-20) to determine the binding kinetics. A series of unliganded biosensors dipped into the analytes served as controls for referencing.

In addition, signals from analyte binding to an irrelevant TCR was used for non-specific binding correction. The traces were processed using ForteBio Data Analysis Software.

Lentiviral transduction for generating T cell lines

The T cell lines were generated as described previously (34).

Briefly, gene blocks (Integrated DNA Technologies) corresponding to the TCRα and TCRβ chains of a given TCRαβ pair were cloned into the EF1a-MCS-GFP-PGK-puro lentiviral vector. Each sequence confirmed (Elim Biopharm) lentiviral plasmid was separately co-transfected with the gag-pol and VSV-G envelope plasmids into Lenti-X 293T cells (Takara Bio) cultured in DMEM media (Thermo Fisher Scientific) supplemented with 10% FBS (R&D Systems) and 100U/ml of penicillin-streptomycin using FuGENE (Promega) transfection reagent. After 72h, lentiviruses for both TCRα and TCRβ constructs were harvested by collecting the culture supernatant.

TCR-deficient Jurkat cells (α−β−) (ATCC) were transduced with the viral supernatant. TCR and CD3 expression was assessed by flow cytometry after staining the cells with anti-TCR α/β (PE, clone 3C10, BioLegend) and anti-CD3 (BV421, clone OKT3, BioLegend) antibodies for 30 min on ice. The cells were washed, resuspended in FACS buffer (PBS with 1% BSA and 2 mM EDTA) and acquired on a BD LSRII flow cytometer.

The data was analyzed using FlowJo (v10) software. If TCR expression after lentiviral transduction was