Les hommes et les femmes ont des réponses immunitaires différentes à l'infection par le SRAS-CoV-2, le sexe masculin étant un facteur de risque de mortalité, en particulier chez les personnes âgées. Cai et al. effectué une analyse métabolomique du sérum de patients COVID-19 et de travailleurs de la santé non infectés et a identifié 17 métabolites associés à la maladie. Cependant, chez les patients masculins COVID-19 uniquement, la quantité du métabolite du tryptophane, l'acide kynurénique (KA), était en corrélation avec l'âge, l'inflammation et l'évolution de la maladie. KA inhibe la libération de glutamate, et l'abondance de glutamate a été réduite chez les patients qui se sont détériorés. Ensemble, ces résultats indiquent que le KA est associé à des différences spécifiques au sexe dans les réponses immunitaires au COVID-19, suggérant qu'il pourrait être ciblé chez les patients de sexe masculin.
Abstrait
La maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) a des résultats cliniques plus faibles chez les hommes que chez les femmes, et les réponses immunitaires sous-tendent ces différences liées au sexe. Parce que les réponses immunitaires sont, en partie, régulées par les métabolites, nous avons examiné les métabolomes sériques des patients COVID-19. Chez les patients de sexe masculin, l'acide kynurénique (KA) et un rapport KA–kynurénine (K) élevé (KA :K) étaient positivement corrélés avec l'âge et avec les cytokines et chimiokines inflammatoires et négativement avec les réponses des lymphocytes T. Les mâles qui se sont détériorés cliniquement avaient un KA :K plus élevé que ceux qui se sont stabilisés. KA inhibe la libération de glutamate, et l'abondance de glutamate était plus faible chez les patients qui se sont détériorés cliniquement et en corrélation avec les réponses immunitaires. L'analyse des données du projet Genotype-Tissue Expression (GTEx) a révélé que l'expression du gène codant pour l'enzyme qui produit la KA, la kynurénine aminotransférase, était corrélée à l'abondance des cytokines et à l'activation des réponses immunitaires chez les mâles plus âgés. Cette étude révèle que le KA a un lien spécifique au sexe avec les réponses immunitaires et les résultats cliniques dans COVID-19, suggérant une rétroaction positive entre les métabolites et les réponses immunitaires chez les hommes.
INTRODUCTION
Il existe des différences liées au sexe dans la gravité et la morbidité de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), le sexe masculin étant un facteur de risque ; par rapport aux femmes, les patients masculins COVID-19 ont un risque accru d'admission [odds ratio (OR), 1.68; 95% confidence interval (CI), 1.45 to 1.90] et la mortalité à l'hôpital (OR, 1,87 ; IC à 95 %, 1,33 à 2,63). Les patients hospitalisés atteints d'une infection modérée par le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) ont des quantités accrues de cytokines et de chimiokines inflammatoires, et des différences entre les sexes existent dans ces réponses immunitaires (1). De plus, à tous les âges, les patientes au départ (lors de leur première admission à l'hôpital) ont une activation des lymphocytes T plus robuste que les hommes. La perte d'activation des lymphocytes T est corrélée à l'âge plus avancé chez les hommes, et cette réponse plus faible des lymphocytes T est corrélée à de plus mauvais résultats de la maladie chez les hommes uniquement (1). Par conséquent, les hommes et les femmes ont des différences claires dans les réponses immunitaires COVID-19 qui sont en corrélation avec l'évolution clinique.
Étant donné que les réponses immunitaires sont régulées, en partie, par les métabolites, il est possible que les différences de métabolisme liées au sexe puissent affecter la réponse immunitaire de l'hôte à l'infection par le SRAS-CoV-2. Par exemple, des métabolites spécifiques sont nécessaires pour les fonctions des macrophages, des neutrophiles et des cellules T, améliorant les voies de synthèse glycolytique et des acides gras dans ces cellules (2). Inversement, la stimulation immunitaire peut également provoquer une reprogrammation métabolique dans les cellules, affectant ainsi la trajectoire de la maladie en modifiant l'abondance des métabolites (3). En plus des exigences métaboliques du système immunitaire de l'hôte, les virus nécessitent également des métabolites et des lipides dérivés de l'hôte (4). Ainsi, l'utilisation de substrats métaboliques pour la réplication virale pourrait affecter la disponibilité des métabolites requis pour les réponses immunitaires.
Dans cette étude, nous avons utilisé une approche métabolomique non ciblée pour identifier les métabolites sériques spécifiques au sexe associés au COVID-19, aux réponses immunitaires et à la gravité de la maladie. Nous avons observé que 17 métabolites étaient associés au COVID-19 ; cependant, chez les patients masculins uniquement, les quantités d'acide kynurénique (KA) sont positivement associées à l'âge, aux cytokines et chimiokines inflammatoires et aux réponses cliniques. De plus, le KA régule négativement le glutamate, et des quantités plus faibles de glutamate ont été observées chez les patients qui se sont détériorés cliniquement. Ces résultats suggèrent un rôle critique de KA dans COVID-19 et une cible potentielle pour une intervention thérapeutique.
RÉSULTATS
Les métabolites sont en corrélation avec COVID-19
Pour déterminer comment les métabolites pourraient médier les différences liées au sexe dans les réponses immunitaires au COVID-19, nous avons d'abord utilisé un flux de travail métabolomique non ciblé avec une régression logistique multivariée pour identifier les métabolites sériques associés au COVID-19. Des échantillons de sérum ont été collectés auprès de 39 patients COVID-19 (n = 22 femmes et n = 17 hommes) le jour de l'inscription à l'étude IMPACT à l'hôpital Yale New Haven (CT, États-Unis). Le moment du prélèvement des échantillons était de 11,4 ± 8,1 et 10,2 ± 6,3 jours après l'apparition des symptômes pour les groupes de patients de sexe féminin et masculin, respectivement (tableau S1). Tous les patients avaient une maladie modérée au moment du prélèvement des échantillons, avec un score clinique de 1 ou 2 et qui avaient besoin de ≤ 3 litres d'oxygène supplémentaire par voie nasale pour maintenir une SpO2 > 92 % (voir Matériels et méthodes), et aucun d'entre eux n'avait reçu de corticostéroïdes à forte dose ou le médicament immunosuppresseur tocilizumab au moment du prélèvement de l'échantillon [cohort A patient group described by Takahashi et al. (1)]. Des témoins de travailleurs de la santé (TS) non infectés ont été inclus dans l'analyse. Il y avait une différence d'âge statistiquement significative entre les patients COVID-19 et les travailleurs de la santé, qui a été ajustée dans nos modèles (tableau S1).
Nous avons d'abord effectué l'identification des métabolites sur les signaux détectés qui étaient présents dans les métabolomes sériques des échantillons de contrôle qualité (CQ) regroupés à la fois chez les patients COVID-19 et les travailleurs de la santé. Nous avons identifié 75 métabolites avec le niveau de confiance le plus élevé (tableau S2). L'analyse de régression logistique a révélé que 17 métabolites étaient associés au statut COVID-19 après ajustement pour l'âge, l'indice de masse corporelle (IMC), le sexe et des comparaisons multiples (tableau S3). Alors que le glutamate, la cystéine-S-sulfate, l'acide palmitoléique, l'acide arachidonique, la lysophosphatidyléthanolamine (22 :6), l'uracile et l'acide myristique étaient positivement associés à COVID-19, glutamine, 3-méthylxanthine, tryptophane, proline, citrulline, homosérine, 2 L'acide 3-dihydroxybenzoïque, l'acide lysophosphatidique (LPA) (18 :2), le LPA (20 :2) et la (14 :0) étaient négativement associés à COVID-19. Des analyses de voies et de réseaux ont été effectuées pour identifier les voies métaboliques et les maladies spécifiques qui étaient surreprésentées dans les métabolites associées positivement ou négativement au COVID-19. L'analyse des voies métaboliques a révélé 17 voies significativement enrichies en métabolites associés au COVID-19 (tableau S4). De plus, huit de ces métabolites étaient surreprésentés dans un réseau composé de trois fonctions de la maladie : maladie immunologique, maladie inflammatoire et réponses inflammatoires (fig. S1). L'analyse du réseau a montré des liens entre les métabolites et l'activation des cytokines, l'activation de la kinase 1/2 régulée par le signal extracellulaire (ERK1/2) et la régulation de la signalisation du glucose et de l'insuline chez les patients COVID-19 (fig. S1).
> 0,5 (fig. S3 et fichier de données S1). Cependant, après stratification par sexe, des corrélations supplémentaires ont été observées entre les métabolites et les marqueurs immunitaires pour chaque sexe indépendamment, suggérant que les réponses immunitaires spécifiques au sexe pourraient être liées au métabolisme (fig. S3 et fichier de données S1).
Un examen plus approfondi a révélé que le KA, un ligand endogène du récepteur aryl hydrocarboné (AhR), qui régule les réponses immunitaires (5), avait des corrélations positives avec les marqueurs immunitaires (fig. S2). Bon nombre de ces corrélations positives ont été observées chez des patients de sexe masculin, y compris des abondances plasmatiques d'antagoniste des récepteurs de l'interleukine-1 (IL-1) (IL-1RA), IL-6, IL-10, facteur de nécrose tumorale-α (TNFα), colonie de macrophages -le facteur de stimulation (M-CSF), le facteur de cellules souches (SCF) et les chimiokines CX3CL1, CXCL9, CXCL13, CCL1, CCL21 et CCL22. De plus, le KA chez les hommes était négativement associé au nombre de cellules T et aux proportions de cellules T CD8+ naïves, de cellules T à mémoire effectrice CD4+ (CD4Tem) et de cellules T à mémoire effectrice CD8+ (CD8Tem) dans les cellules T (Fig. 1, A et B). Chez les patientes, le KA n'était positivement associé qu'aux abondances plasmatiques d'IL-12p40, de CCL3, de CXCL9 et de SCF (Fig. 1, A et B). En résumé, des différences spécifiques au sexe dans les corrélations entre les métabolites et les réponses immunitaires ont été observées chez les patients COVID-19, où KA avait le lien le plus important avec la réponse immunitaire chez les hommes.
Fig. 1 Métabolites de la voie du tryptophane et réponses immunitaires.(UNE) Corrélation entre les intensités des ions KA et les marqueurs immunitaires chez les hommes atteints de COVID-19 (Pt. M, n = 17) et les femmes atteintes de COVID-19 (Pt. F, n = 22). Les intervalles de confiance (IC) à 95 % pour les coefficients de corrélation sont indiqués sous forme de zones ombrées colorées en fonction du sexe du patient. (B) Carte thermique montrant la corrélation entre les métabolites du tryptophane et les marqueurs immunitaires chez les hommes et les femmes atteints de COVID-19. Les corrélations de Spearman >0,5 ou 0,5 ou 92%; 3 : received tocilizumab, which per hospital treatment protocol required that the patient has >3 liters of supplemental oxygen to maintain an SpO2 of >92% or has >2 liters of supplemental oxygen to maintain an SpO2 of >92% and had a high-sensitivity C-reactive protein of >70; 4 : the patient required intensive care unit–level care; 5 : the patient required intubation and mechanical ventilation. In relation to the World Health Organization (WHO) scoring, our clinical scores 1, 2/3, 4, and 5 largely correspond to WHO scores 3, 4, 5, and 6/7, respectively (37). All the patients enrolled in this study had a clinical score of 1 or 2 at the time of sample collection (1.3 ± 0.5 and 1.4 ± 0.5 for female and male patient groups, respectively; table S1), and the patients were categorized into the stabilized group and the deteriorated group according to their clinical trajectory after sample collection. If the patient’s score remained at 1 or 2 throughout the admission, the patient was categorized to the stabilized group, and if the score increased to 3 or more at any time during admission, the patient was categorized to the deteriorated group. Detailed demographic information on the patients was previously published (1). For the patients who were 90 years old or older, their ages were protected health information, and 90 was put as the surrogate value for the analyses. Individuals with active chemotherapy against cancers, pregnant patients, patients with background hematological abnormalities, patients with autoimmune diseases, and patients with a history of organ transplantation and that were on immunosuppressive agents were excluded from this study.
Serum metabolite extraction
Serum samples (50 μl) were thawed and deactivated for COVID-19 in 150 μl of acetone :methanol (50 :50, v/v) for 60 min at room temperature. Control samples were treated in exactly the same manner. To precipitate proteins, the samples were incubated for 2 hours at −20°C, which was followed by centrifugation at 15,000g at 4°C for 15 min. The resulting supernatant was removed and evaporated to dryness for 12 hours with a vacuum concentrator (Thermo Fisher Scientific). The dry extracts were then reconstituted in 100 μl of acetonitrile :H2O (1 :1, v/v), sonicated for 10 min, and centrifuged at 15,000g at 4°C for 15 min to remove insoluble debris. The supernatants were transferred to ultraperformance liquid chromatography (UPLC) autosampler vials (Thermo Fisher Scientific). A pooled QC sample was prepared by mixing 5 μl of extracted solution from each sample into a similar UPLC vial. All the vials were then capped and stored at −80°C before being subjected to UPLC–mass spectrometry (MS) analysis.
UPLC-MS–based metabolomics analysis
7 μm7 μm; 100 mm (length) by 2.1 mm (i.d.)] were used for the UPLC-based separation of metabolites. The column temperature was kept at 25°C for HILIC-MS analysis and at 30°C for RPLC-MS analysis. The solvent flow rate was 0.5 ml/min, and the sample injection volume was 4 μl for HILIC-MS and RPLC in positive mode analysis, 2 μl for HILIC-MS in negative mode, and 6 μl for RPLC-MS in negative mode. For HILIC-MS analysis, mobile phase A was 25 mM NH4OH and 25 mM NH4OAc in water, whereas mobile phase B was acetonitrile, for both electrospray ionization (ESI), positive and negative mode. The linear gradient was set as follows: 0 to 0.5 min, 95% B; 0.5 to 7 min, 95% B to 65% B; 7 to 8 min, 65% B to 40% B; 8 to 9 min, 40% B; 9 to 9.1 min, 40% B to 95% B; 9.1 to 12 min, 95% B. For RPLC-MS analysis, mobile phase A was 0.1% formic acid in H2O, whereas mobile phase B was 0.1% formic acid in acetonitrile, for ESI+. Mobile phase A was 5 mM NH4OAc in H2O, while mobile phase B was acetonitrile for ESI−. The linear gradient was set as follows: 0 to 1 min, 1% B; 1 to 8 min, 1% B to 100% B; 8 to 10 min, 100% B; 10 to 10.1 min, 100% B to 1% B; 10.1 to 12 min, 1% B. The LC-MS system was conditioned with eight QC samples before analysis. Serum samples were injected into the LC-MS system in a randomized order. Pooled samples were analyzed every eight injections during the UPLC-MS analysis to monitor the stability of the data acquisition and were used for subsequent data normalization. QTOF scan data (300 ms per scan; mass scan range, 50 to 1000 Da) were initially acquired for each biological sample for metabolite quantification. Then, both data-dependent acquisition data [QTOF scan time : 100 ms per scan; MSMS scan time : 500 ms per scan; collision energy : 20 eV; top five most intense ions were selected for fragmentation, exclude former target ions (4 s after two occurrences)] and MSE data (low-energy scan : 300 ms per scan, collision energy : 6 eV; high-energy scan : 300 ms per scan, collision energy : 20 eV, mass scan range : 25 to 1000 Da) were acquired for QC samples to enable metabolite identification. ESI source parameters on the Xevo GS-XS QTOF were set as follows: Capillary voltage of 1.8 kV was used in ESI negative mode, and 2.5 kV was used in ESI positive mode; sampling cone, 30 V; source temperature, 100°C; desolvation temperature, 550°C; cone gas flow, 40 liters/hour; desolvation gas flow, 900 liters/hour.
UPLC-MS data processing
The raw MS data (.raw) were converted to mzML files with ProteoWizard MSConvert software (version 3.0.6150, www.proteowizard.sourceforge.net/). The parameters of minimum SNR (signal-to-noise ratio) and minimum peak spacing were set at 0.1 for peak-picking in ProteoWizard. The files were then processed in R (version 3.4.3) with the XCMS package for feature detection, retention time correction, and alignment (38). The XCMS processing parameters were optimized and set as follows: mass accuracy for peak detection = 20 ppm, peak width c = (2, 30), snthresh = 6, bw = 10, mzwid = 0.015, minfrac = 0.5. The CAMERA package was used for subsequent peak annotation. The resulting data were normalized using the support vector regression algorithm in R to remove an unwanted system error that occurred among intra- and interbatches (39). The generated data were subjected to principal components analysis, which demonstrated good analytical reproducibility as revealed by clustering of QC samples (fig. S7). Metabolic features in the QC sample with relative SD < 30% were used for subsequent statistical analyses. Initial metabolite identification was performed with the MetDNA algorithm (40). Metabolites were further identified by matching retention time with an in-house metabolite standard library. In addition, metabolite identification was performed by matching accurate mass and experimental MS/MS data against online databases (METLIN and HMDB). value of 0.5 to 1.0 to mark moderate–to–very high correlations (41). Heatmaps were plotted using the “pheatmap” R package. Gene transcripts per million (TPMs), subject phenotypes, and sample attributes data were downloaded from GTEX Portal (gtexportal.org, accession : phs000424.v8.p2). After the TPM values were transformed as log10(TPM + 1), composite expression scores were calculated by adding the individual expression values together. Patients who were 60 years or older were coded as “Older,” whereas patients 30 years or younger were coded as “Young.” After loading the expression data into R with the CePa package, Pearson correlation coefficients were calculated for pairs of target genes within each tissue of each sex, and data were visualized as a heatmap displaying the difference between the male and female coefficients using the ComplexHeatmap package. Male-specific correlations were validated by scatter plots and linear regressions, which were generated using the ggplot2 R package.
Statistical analysis
For untargeted metabolomics data, the statistically significant P value of each feature in the logistical model was determined, which was followed by a Benjamini-Hochberg–based FDR correction of the P value to calculate the corresponding q value. Metabolites were considered as significantly associated when q < 0.05.
Pathway analysis
Canonical metabolic pathway and network analyses were performed with Ingenuity Pathway Analysis software (QIAGEN, www.qiagen.com/ingenuity) to identify a network of connected pathways, diseases, and functions that were overrepresented in the metabolites associated with COVID-19. Each metabolite was mapped using the Ingenuity Pathway Knowledge Base. Significant (Benjamini-Hochberg FDR, P Acknowledgments: We acknowledge the study participants for time and commitment to the study. We thank all members of the clinical team at Yale New Haven Hospital for dedication and work, which made this study possible. Funding : This work was, in part, supported by a gift from the YSPH Rapid Response Fund, Women’s Health Research at Yale Pilot Project Program, Fast Grant from Emergent Ventures at the Mercatus Center, Mathers Foundation, the Beatrice Kleinberg Neuwirth Fund, and the Ludwig Family Foundation. IMPACT received support from the Yale COVID-19 Research Resource Fund. A.I. is an Investigator of the Howard Hughes Medical Institute. D.J.K. was a Paul and Daisy Soros Fellow and was supported by a grant from the National Cancer Institute (NCI) of the NIH (F30CA236466) and by an MSTP training grant from the NIH (T32GM007205, T32GM136651). S.A.K. was supported by CTSA Grant Number UL1TR001863 from the National Center for Advancing Translational Science (NCATS), components of the NIH, NIH roadmap for Medical Research, and the Lampman Research Fund in Yale Surgical Oncology. Support was also provided by the Beatrice Kleinberg Neuwirth Fund, Yale Schools of Public Health and Medicine, and NIH U19 AI08992 awarded to A.I.K. Author contributions: All authors contributed to data discussions and the writing of this manuscript. Y.C. performed the metabolomics MS and data analysis and prepared figures and tables. D.J.K. designed and performed the gene expression analysis and interpreted the results. T.T. was involved in acquiring the biospecimens and in experimental design. D.I.B. validated the statistical analysis design and reproduced the data independently. S.M. assisted with the biostatistics in the manuscript. N.J.W.R. was involved in experimental design and figure design. A.C.-M. A.J.M. and M.C.M. acquired the biospecimens and performed viral inactivation. B.I. J.K. C.L. T.M. J.E.O. J.S. and P.W. acquired immune cell data. A.I.K. contributed to data and clinical interpretation. S.A.K. contributed to data interpretation and clinical discussions on data. A.I. was involved in acquiring the biospecimens and experimental design, securing funds, and supervising the study. C.H.J. was involved in experimental design, data analysis, drafting the initial manuscript, securing funds, and supervising the study. Y.C. D.I.B. C.H.J. and N.J.W.R. are members of the COVID-19 Mass Spectrometry Coalition (42). Yale IMPACT Research Team members (in alphabetical order) : T. Alpert, K. Anastasio, M. H. Askenase, M. Batsu, S. Bermejo, S. Bickerton, A. Brito, K. Brower, M. L. Bucklin, S. Cahill, M. Campbell, Y. Cao, E. Courchaine, R. Datta, G. Deluliis, C. Dela Cruz, R. Earnest, S. Farhadian, J. Fauver, R. Filler, J. Fournier, B. Geng, L. Glick, N. Grubaugh, R. Handoko, C. Harden, C. Jensen, C. Kalinich, W. Khoury-Hanold, L. Knaggs, M. Kuang, E. Kudo, S. Lapidus, J. Lim, M. Linehan, F. Liu, P. Lu, A. Lu-Culligan, M. Minasyan, A. A. Malik, A. Martin, I. Matos, D. McDonald, M. Nakahata, N. Naushad, A. Nelson, J. Nouws, A. Nuñez, M. Nunez-Smith, A. Obaid, C. Odio, J. Eun Oh, S. B. Omer, I. M. Ott, A. Park, H.-J. Park, X. Peng, M. Petrone, S. Prophet, H. Rahming, T. Rice, A. Ring, K.-A. Rose, L. Sewanan, L. Sharma, A. Shaw, D. Shepard, E. Silva, M. Smolgovsky, E. Song, N. Sonnert, Y. Strong, C. Todeasa, M. Tokuyama, J. Valdez, S. Velazquez, A. Venkataraman, P. Vijayakumar, C. B. F. Vogels, E. Y. Wang, A. Watkins, E. B. White, A. L. Wyllie, and Y. Yang. Competing interests: The authors declare that they have no competing interests. Data and materials availability : Untargeted metabolomics data, metabolomics protocols, and code are available on the MetaboLights data repository accession number MTBLS1987 (www.ebi.ac.uk/metabolights/). Clinical and immunological data are available from a previous study (1). Data processing R code is available in data file S3. All data needed to evaluate the conclusions in the paper are present in the paper or the Supplementary Materials. This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0) license, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. To view a copy of this license, visit https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. This license does not apply to figures/photos/artwork or other content included in the article that is credited to a third party; obtain authorization from the rights holder before using such material.
